JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

Published: April 23, 2021
doi:
10.3791/62009
, , , , , ,
1Department of Surgery,Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation,Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering,Louisiana State University, 5Department of Medicine,Tulane University School of Medicine

Summary

이 프로토콜은 선반 재료가 없는 1차 인간 유방 조직을 사용하여 유방암을 연구하기 위한 체외 미생물 시스템의 건설을 설명합니다.

Abstract

유방암 (BC)은 여성을위한 주요 사망 원인으로 남아 있습니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고 BC 주 약의 97%가 임상 시험에 실패합니다. 따라서 질병에 대한 우리의 이해를 향상시키기 위해 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물시스템(MPS) 프로그램은 기초과학 발견의 임상번역을 개선하고 새로운 치료 전략을 약속하기 위해 개발되었다. 여기에서 우리는 유방암을 위한 MPS를 생성하는 방법을 제시합니다 (BC-MPS). 이 모델은 지방 유래 줄기 세포 시트 (ASC) 사이에 WAT를 끼운하여 1 차 인간 백색 지방 조직 (WAT)을 배양하는 이전에 설명된 접근 방식을 조정합니다. 우리의 BC-MPS의 새로운 양상은 종아메리카세포 외 매트릭스, 성숙한 세포세포, 상주 섬유아세포 및 면역 세포를 포함하는 비병인간 유방 조직 (HBT)으로 BC 세포를 종향하는 것을 포함합니다; 및 HBT 유래 ASC 시트 사이에 BC-HBT 혼화제를 끼우고. 결과 BC-MPS는 적어도 14 일 동안 문화 전 생체 에서 안정적입니다. 이 모델 시스템에는 선포세포, 기질 세포, 면역 세포 및 세포 외 매트릭스를 포함하여 BC에 영향을 미치는 마이크로 환경의 여러 요소가 포함되어 있습니다. 따라서 BC-MPS는 BC와 그 마이크로 환경 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

우리는 암 진행과 전이에 영향을 미치는 것으로 알려진 두 개의 BC 동작을 연구하여 BC-MPS의 장점을 보여줍니다 : 1) BC 운동성과 2) BC-HBT 대사 크로스토크. BC 운동성은 이전에 인트라바이탈 이미징을 사용하여 입증되었지만 BC-MPS는 며칠 동안 형광 현미경 검사를 사용하여 고해상도 시간 경과 이미징을 허용합니다. 더욱이, 대사 크로스토크는 이전에 BC 세포와 미숙한 선포세포로 분화된 뮤린 프리-아포세포를 사용하여 입증되었지만, 우리의 BC-MPS 모델은 1차 인간 유방 선포세포와 체외세포 사이의 이 교차토크를 보여주는 최초의 시스템입니다.

Introduction

매년 40,000명 이상의 미국 여성이 유방암(BC)1로사망합니다. 매년 BC 연구에 7억 달러 이상을 투자했음에도 불구하고, 후보 BC 약물의 97%가 임상 시험2,3에실패합니다. 신약 개발 파이프라인과 BC에 대한 이해를 개선하기 위해서는 새로운 모델이 필요합니다. NIH 미생물학(MPS) 프로그램은 기본 과학을 임상성공4로 번역하는 것을 개선하기 위한 획기적인 모델에 필요한 특징을 설명했습니다. 이들은 1 차적인 인간 세포 또는 조직의 사용을 포함, 4 주 동안 문화에 안정, 네이티브 조직 아키텍처 및 생리 반응의 포함.

BC 세포주 2차원 배양, 멤브레인 삽입 공동 배양, 3차원 스페로이드 및 오르가노이드와 같은 현재 시험관 내 BC 모델은 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못하기 때문에 이러한 생체 조직 아키텍처를 재구성하지 않기 때문이다. 세포 외 매트릭스 (ECM)가 이러한 시스템에 추가되면 유방 ECM이 사용되지 않습니다. 대신 콜라겐 젤과 지하 멤브레인 행렬이 사용됩니다.

환자 유래 제노이식(PDX)과 같은 생체 내 시스템은 유사하게 Murine 유방 조직이 인간의 가슴과 크게 다르기 때문에 NIH의 MPS 기준을 충족시키지 못합니다. 더욱이, 면역 계통-BC 상호 작용은 종양 발달에 있는 열쇠로 점점 인식되고 있습니다, 그러나 PDX 종양을 생성하기 위하여 이용된 면역타협한 뮤린 모형은 성숙한 T 세포, B 세포 및 자연적인 살인자 세포부족. 더욱이, PDX는 1차 유방 종양을 유지 및 확장할 수 있도록 허용하지만, 생성된 PDX 종양은 1차 뮤린 기질 세포 및 ECM5로침투된다.

이러한 과제를 극복하기 위해 NIH MPS 기준을 충족하는 새로운 ex vivo, 입체적인 인간 유방 MPS를 개발했습니다. 우리의 유방 MPS의 기초는 또한 HBT(그림 1)에서분리된 지방 유래 줄기 세포의 2장 사이 1 차 인간 유방 조직 (HBT)를 샌드위치해서 만들어집니다. HBT를 샌드위치로 셀 시트를 전송하는 플런저는 간단한 아크릴 플라스틱(그림 1H,I)으로3D 인쇄 되거나 만들 수 있습니다. 이 기술은 1 차적인 인간 백색 반포세포 조직을 배양하기 위한 우리의 이전에 기술된 접근 방식을 적응합니다6,7. 유방 MPS는 표준 BC 세포주에서 1 차적인 인간 유방 종양에 구역 수색하는 선택의 BC 모형에 의해 그 때 시드될 수 있습니다. 여기서, 우리는 이러한 BC-MPS가 여러 주 동안 문화에서 안정되어 있음을 보여줍니다(그림 2); 유방 선포세포, ECM, 내피, 면역 세포와 같은 HBT의 토착 요소를 포함한다(도 3); 대사 크로스토크(도4)와같은 BC와 HBT 간의 생리적 상호작용을 재구성한다. 마지막으로, BC-MPS는 HBT(도5)를통해 BC 세포의 아모에이드 이동연구를 허용한다는 것을 보여준다.

Protocol

모든 인간 조직은 LSUHSC의 기관 검토 위원회 사무소의 승인에 따라 프로토콜 #9189 따라 수집되었습니다. 1. 세포 시트에 대한 Adipose 유래 줄기 세포 (ASC)의 파종 상용 소스에서 ASC를 구입하거나 확립 된프로토콜8을따라 1 차 인간 유방 조직으로부터 분리8,9. 종자 인간 유방 ASC70% 밀도 (~80,000 세포/cm2 표면적) 6-well 표준 조…

Representative Results

문화의 안정성BC-MPS는 적어도 14 일 동안 시험관 내에서 배양 될 수있는 안정적인 미생물 학적 시스템입니다. ASC 세포 시트의 브라이트필드 이미지는 컨서크시트(도 2A)의줄무늬 패턴을 표시하기 위해 100배율로 촬영하였다. ASC 세포 시트는 적어도 4 주 동안 배양에서 안정적입니다. BC-MPS는 14일 동안 6웰 플레이트의 한 우물에서 양문화?…

Discussion

인간의 유방암 모델링을 위한 새로운 시스템은 질병의 더 나은 이해를 개발하기 위하여 필요합니다. 네이티브 ECM 및 기질 세포를 포함하는 질병 설정을 모델링하는 인간 미생물 시스템의 개발은 전임상 연구의 예측 능력을 증가시킬 것이다. 여기에 제시된 BC-MPS 모델은 기존 모델의 한계를 극복하여 네이티브 HBT 환경에서 BC를 평가할 수 있는 새로 개발된 시스템입니다. 이 시스템은 암 세포주 또?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

툴레인 플로우 세포측정및 셀 정렬 코어뿐만 아니라 툴레인 히스토로지 코어에 기술 지원을 감사드립니다. 이 작품은 성형 및 재건 외과 의사의 남동부 사회에 의해 지원되었다 2019 연구 보조금과 국립 과학 재단 (EPSCoR 트랙 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Ricerca sul cancro. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Breast CancerMicrophysiological SystemEx VivoAdipocytesImmune CellsVascular StructuresDuctal StructuresExtracellular MatrixPersonalized MedicinePharmaceutical DevelopmentTumor InitiationFibrosisExtracellular Matrix RemodelingGelatinPNIPAAmASCsPBSRazor BladeCancer Cell LinesBC-MPS Media
check_url/it/62009?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image