Modellering av brystkreft i humant brystvev ved hjelp av et mikrofysiologisk system
Summary
Denne protokollen beskriver byggingen av et in vitro mikrofysiologisk system for å studere brystkreft ved hjelp av primært humant brystvev med hyllematerialer.
Abstract
Brystkreft (BC) er fortsatt en ledende dødsårsak for kvinner. Til tross for mer enn $ 700 millioner investert i BC-forskning årlig, mislykkes 97% av kandidaten BC-legemidler kliniske studier. Derfor er det nødvendig med nye modeller for å forbedre vår forståelse av sykdommen. NIH Microphysiological Systems (MPS)-programmet ble utviklet for å forbedre den kliniske oversettelsen av grunnleggende vitenskapsfunn og lovende nye terapeutiske strategier. Her presenterer vi en metode for å generere MPS for brystkreft (BC-MPS). Denne modellen tilpasser en tidligere beskrevet tilnærming til å dyrke primært humant hvitt fettvev (WAT) ved å smøre WAT mellom fettavledede stamceller (ASC) s. Nye aspekter ved bc-MPS inkluderer såing BC celler i ikke-syke menneskelige brystvev (HBT) som inneholder innfødt ekstracellulær matrise, modne adipocytter, bosatte fibroblaster og immunceller; og smøring av BC-HBT-blandingen mellom HBT-avledede ASC-ark. Den resulterende BC-MPS er stabil i kultur ex vivo i minst 14 dager. Dette modellsystemet inneholder flere elementer i mikromiljøet som påvirker BC, inkludert adipocytter, stromale celler, immunceller og den ekstracellulære matrisen. Dermed kan BC-MPS brukes til å studere interaksjonene mellom BC og dets mikromiljø.
Vi demonstrerer fordelene ved vår BC-MPS ved å studere to BC-atferd som er kjent for å påvirke kreftprogresjon og metastase: 1) BC motilitet og 2) BC-HBT metabolsk krysstale. Mens BC-motilitet tidligere har blitt demonstrert ved hjelp av intravital avbildning, tillater BC-MPS høyoppløselig tidsforløpavbildning ved hjelp av fluorescensmikroskopi over flere dager. Videre, mens metabolsk krysstale tidligere ble demonstrert ved hjelp av BC-celler og murine pre-adipocytter differensiert til umodne adipocytter, er vår BC-MPS-modell det første systemet som demonstrerer denne krysstale mellom primære menneskelige pattedyr adipocytter og BC celler in vitro.
Introduction
Hvert år dør mer enn 40 000 amerikanske kvinner av brystkreft (BC)1. Til tross for mer enn $ 700 millioner investert i BC forskning årlig, 97% av kandidaten BC narkotika mislykkes kliniske studier2,3. Nye modeller er nødvendig for å forbedre rørledningen for narkotikautvikling og vår forståelse av BC. NIH Microphysiological (MPS) Program avgrenset funksjonene som kreves for banebrytende modeller for å forbedre oversettelsen av grunnleggende vitenskap til klinisk suksess4. Disse inkluderte bruk av primære menneskelige celler eller vev, stabil i kultur i 4 uker, og inkludering av innfødt vevsarkitektur og fysiologisk respons.
Nåværende in vitro BC-modeller, for eksempel todimensjonal kultur av BC-cellelinjer, membraninnsatskokultur og tredimensjonale sfæroider og organoider, oppfyller ikke NIHs MPS-kriterier fordi ingen av disse rekapitulerer innfødt brystvevsarkitektur. Når ekstracellulær matrise (ECM) legges til disse systemene, brukes ikke bryst ECM; I stedet brukes kollagengeler og kjellermembranmatriser.
Nåværende in vivo-systemer, som pasientavledede xenografter (PDX), oppfyller på samme måte ikke NIHs MPS-kriterier fordi murinpattedyrvev i stor grad skiller seg fra menneskelige bryster. Videre er immunsystem-BC interaksjoner i økende grad anerkjent som nøkkelen i tumorutvikling, men de immunkompromitterte murinmodellene som brukes til å generere PDX-svulster, mangler modne T-celler, B-celler og naturlige morderceller. Videre, mens PDX tillater at primære brystsvulster opprettholdes og utvides, blir de resulterende PDX-svulstene infiltrert med primære murinstromale celler og ECM5.
For å overvinne disse utfordringene har vi utviklet en roman, ex vivo, tredimensjonal human breast MPS som oppfyller NIH MPS-kriteriene. Grunnlaget for vårt bryst MPS er laget ved å smøre primært humant brystvev (HBT) mellom to ark med fettavledede stamceller (ASC), også isolert fra HBT (Figur 1). Stempel for overføring av cellearkene til sandwich HBT kan skrives ut eller lages av enkel akrylplast (Figur 1H,I). Denne teknikken tilpasser vår tidligere beskrevne tilnærming for å dyrke primært humant hvitt adipocyttvev6,7. Brystet MPS kan deretter bli sådd av en BC modell av valg, alt fra standard BC cellelinjer til primære menneskelige bryst svulster. Her viser vi at disse BC-MPS er stabile i kultur i flere uker (Figur 2); inkluderer innfødte elementer av HBT som pattedyr adipocytter, ECM, endotel, immunceller (Figur 3); og rekapitulere de fysiologiske interaksjonene mellom BC og HBT, for eksempel metabolsk krysstale (figur 4). Til slutt viser vi at BC-MPS tillater studiet av amoeboid bevegelse av BC-celler gjennom HBT (Figur 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nye systemer for modellering av human brystkreft er nødvendig for å utvikle en bedre forståelse av sykdommen. Utvikling av menneskelige mikrofysiologiske systemer for å modellere sykdomsinnstillinger som inkluderer innfødte ECM- og stromale celler, vil øke den prediktive kraften i prekliniske studier. BC-MPS-modellen som presenteres her, er et nyutviklet system som overvinner begrensningene til tidligere modeller som gjør det mulig å evaluere BC i sitt opprinnelige HBT-miljø. Dette systemet kan brukes med kreftc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core samt Tulane Histology Core for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant og National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
Riferimenti
- DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
- . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
- Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
- Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
- Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
- Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
- Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
- Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
- Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
- Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Ricerca sul cancro. 71 (7), 2455-2465 (2011).
- Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
- Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
- Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
- Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
- Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
- Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
- Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
- Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
- Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
- Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).
