Modelando o câncer de mama no tecido mamário humano usando um sistema microfisiológico
Summary
Este protocolo descreve a construção de um sistema microfisiológico in vitro para o estudo do câncer de mama usando tecido mamário humano primário com materiais fora da prateleira.
Abstract
O câncer de mama (BC) continua sendo a principal causa de morte das mulheres. Apesar dos mais de US$ 700 milhões investidos em pesquisas do BC anualmente, 97% dos medicamentos candidatos do BC falham em testes clínicos. Portanto, novos modelos são necessários para melhorar nossa compreensão da doença. O programa NIH Microphysiological Systems (MPS) foi desenvolvido para melhorar a tradução clínica de descobertas científicas básicas e prometendo novas estratégias terapêuticas. Aqui apresentamos um método de geração de MPS para câncer de mama (BC-MPS). Este modelo adapta uma abordagem previamente descrita de tecido adiposo branco humano primário (WAT) por sanduíche wat entre folhas de células-tronco derivadas de adipose (ASC)s. Novos aspectos do nosso BC-MPS incluem a semeadura de células BC em tecido mamário humano não doente (HBT) contendo matriz extracelular nativa, adipócitos maduros, fibroblastos residentes e células imunes; e sanduíches a mistura BC-HBT entre folhas ASC derivadas do HBT. O BC-MPS resultante é estável na cultura ex vivo por pelo menos 14 dias. Este sistema de modelo contém múltiplos elementos do microambiente que influenciam o BC, incluindo adipócitos, células estromais, células imunes e a matriz extracelular. Assim, o BC-MPS pode ser usado para estudar as interações entre o BC e seu microambiente.
Demonstramos as vantagens do nosso BC-MPS ao estudar dois comportamentos bc conhecidos por influenciar a progressão do câncer e a metástase: 1) motilidade bc e 2) conversa cruzada metabólica BC-HBT. Embora a motilidade bc tenha sido anteriormente demonstrada usando imagens intravitais, o BC-MPS permite imagens de lapso de tempo de alta resolução usando microscopia de fluorescência ao longo de vários dias. Além disso, enquanto o crosstalk metabólico foi previamente demonstrado usando células BC e pré-adipócitos murinas diferenciadas em adipócitos imaturos, nosso modelo BC-MPS é o primeiro sistema a demonstrar esse crosstalk entre adipócitos mamários primários e células BC in vitro.
Introduction
Todos os anos, mais de 40.000 mulheres norte-americanas morrem de câncer de mama (BC)1. Apesar de mais de US$ 700 milhões investidos em pesquisa do BC anualmente, 97% dos medicamentos candidatos do BC reprovam os ensaios clínicos2,3. Novos modelos são necessários para melhorar o pipeline de desenvolvimento de medicamentos e nosso entendimento do BC. O Programa De Microfisiológico (MPS) do NIH delineou os recursos necessários para modelos inovadores para melhorar a tradução da ciência básica para o sucesso clínico4. Estes incluíram o uso de células ou tecidos humanos primários, estáveis na cultura por 4 semanas, e inclusão da arquitetura de tecido nativo e resposta fisiológica.
Os modelos atuais in vitro BC, como a cultura bidimensional das linhas celulares BC, a cocultura de inserção de membrana e esferoides tridimensionais e organoides, não atendem aos critérios de MPS do NIH porque nenhum desses recapitulam a arquitetura do tecido mamário nativo. Quando a matriz extracelular (ECM) é adicionada a esses sistemas, o ECM mamário não é utilizado; em vez disso, géis de colágeno e matrizes de membrana de porão são usados.
Os sistemas in vivo atuais, como os xenoenxertos derivados da paciente (PDX), da mesma forma não atendem aos critérios de MPS do NIH, pois os tecidos mamários murinas diferem muito das mamas humanas. Além disso, as interações do sistema imunológico-BC são cada vez mais reconhecidas como chave no desenvolvimento do tumor, mas os modelos de murina imunocomprometidos usados para gerar tumores PDX carecem de células T maduras, células B e células assassinas naturais. Além disso, enquanto o PDX permite que os tumores primários de mama sejam mantidos e expandidos, os tumores PDX resultantes são infiltrados com células estromais murinas primárias e ECM5.
Para superar esses desafios, desenvolvemos um mps de mama humano novo, ex vivo, tridimensional que atende aos critérios do NIH MPS. A base do mps da mama é feita por sanduíche de tecido mamário humano primário (HBT) entre duas folhas de células-tronco derivadas de adipose (ASCs), também isoladas do HBT(Figura 1). Os êmbolos para transferir as folhas de celular para sanduíche o HBT podem ser impressos em 3D ou feitos de simples plásticos acrílicos(Figura 1H,I). Esta técnica adapta nossa abordagem previamente descrita para a cultura do tecido adipócito branco humano primário6,7. A MPS mamária pode então ser semeada por um modelo de escolha BC, que vai desde linhas celulares padrão BC até tumores primários de mama humana. Aqui, mostramos que esses BC-MPS estão estáveis na cultura por várias semanas(Figura 2); incluem elementos nativos do HBT, tais como adipócitos mamários, ECM, endotélio, células imunes(Figura 3); e recapitular as interações fisiológicas entre BC e HBT, como crosstalk metabólico(Figura 4). Por fim, mostramos que o BC-MPS permite o estudo do movimento ameboide das células BC ao longo do HBT (Figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Novos sistemas de modelagem do câncer de mama humano são necessários para desenvolver uma melhor compreensão da doença. O desenvolvimento de sistemas microfisiológicos humanos para modelar ambientes de doenças que incluem ECM nativo e células estromais aumentará o poder preditivo dos estudos pré-clínicos. O modelo BC-MPS aqui apresentado é um sistema recém-desenvolvido que supera as limitações dos modelos anteriores permite a avaliação do BC em seu ambiente HBT nativo. Este sistema pode ser usado com lin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Núcleo de Citometria de Fluxo de Tulane e ao Núcleo de Triagem celular, bem como ao Núcleo de Histologia de Tulane pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Sudeste de Cirurgiões Plásticos & Reconstrutivos 2019 Research Grant e pela National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
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