Моделирование рака молочной железы в ткани молочной железы человека с использованием микрофизиологической системы
Summary
Этот протокол описывает построение микрофизиологической системы in vitro для изучения рака молочной железы с использованием первичной ткани молочной железы человека с готовыми материалами.
Abstract
Рак молочной железы (БК) остается основной причиной смерти женщин. Несмотря на то, что ежегодно в исследования BC инвестируется более 700 миллионов долларов, 97% препаратов-кандидатов не проходят клинические испытания. Поэтому необходимы новые модели, чтобы улучшить наше понимание болезни. Программа NIH Microphysiological Systems (MPS) была разработана для улучшения клинического перевода фундаментальных научных открытий и перспективных новых терапевтических стратегий. Здесь мы представляем метод генерации MPS для рака молочной железы (BC-MPS). Эта модель адаптирует ранее описанный подход культивирования первичной белой жировой ткани человека (WAT) путем сэндвичинга WAT между листами стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASC). Новые аспекты нашего BC-MPS включают посев клеток BC в небольшнюю ткань молочной железы человека (HBT), содержащую нативный внеклеточный матрикс, зрелые адипоциты, резидентные фибробласты и иммунные клетки; и сэндвичинг примеси BC-HBT между листами ASC, полученными из HBT. Полученный BC-MPS стабилен в культуре ex vivo в течение не менее 14 дней. Эта модельная система содержит несколько элементов микросреды, которые влияют на БК, включая адипоциты, стромальные клетки, иммунные клетки и внеклеточный матрикс. Таким образом, BC-MPS может быть использован для изучения взаимодействий между BC и его микросредой.
Мы демонстрируем преимущества нашего BC-MPS, изучая два поведения BC, которые, как известно, влияют на прогрессирование рака и метастазирование: 1) подвижность BC и 2) метаболические перекрестные помехи BC-HBT. В то время как подвижность BC ранее была продемонстрирована с использованием прижизальной визуализации, BC-MPS позволяет получать покадровую визуализацию с высоким разрешением с использованием флуоресцентной микроскопии в течение нескольких дней. Кроме того, в то время как метаболические перекрестные помехи были ранее продемонстрированы с использованием клеток BC и мышиных преадипоцитов, дифференцированных в незрелые адипоциты, наша модель BC-MPS является первой системой, демонстрирующей этот перекрестный разговор между первичными адипоцитами молочной железы человека и клетками BC in vitro.
Introduction
Каждый год более 40 000 женщин США умирают от рака молочной железы (BC)1. Несмотря на то, что ежегодно в исследования BC инвестируется более 700 миллионов долларов, 97% препаратов-кандидатов BC не проходят клинические испытания2,3. Новые модели необходимы для улучшения конвейера разработки лекарств и нашего понимания БК. Микрофизиологическая программа NIH (MPS) очерчена функции, необходимые для прорывных моделей для улучшения перевода фундаментальной науки в клинический успех4. Они включали использование первичных клеток или тканей человека, стабильных в культуре в течение 4 недель, и включение нативной тканевой архитектуры и физиологического ответа.
Современные модели IN vitro BC, такие как двумерная культура клеточных линий BC, кокультура мембранных вставок и трехмерные сфероиды и органоиды, не соответствуют критериям MPS NIH, потому что ни один из них не повторяет архитектуру нативной ткани молочной железы. Когда к этим системам добавляется внеклеточный матрикс (ECM), ECM молочной железы не используется; вместо этого используются коллагеновые гели и матрицы базальных мембран.
Современные системы in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), также не соответствуют критериям MPS NIH, потому что мышиные ткани молочной железы значительно отличаются от человеческой груди. Кроме того, взаимодействия иммунной системы и BC все чаще признаются ключевыми в развитии опухоли, но иммунокомпрометированные мышиные модели, используемые для генерации опухолей PDX, не имеют зрелых Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров. Кроме того, в то время как PDX позволяет поддерживать и расширять первичные опухоли молочной железы, полученные опухоли PDX инфильтрируются первичными мышиными стромальными клетками и ECM5.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали новый, ex vivo, трехмерный MPS человеческой груди, который соответствует критериям NIH MPS. Основа нашей молочной mpS производится путем сэндвичинга первичной ткани молочной железы человека (HBT) между двумя листами стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASC), также выделенных из HBT(рисунок 1). Плунжеры для переноса листов ячеек на сэндвич HBT могут быть напечатаны на 3D-принтере или изготовлены из простых акриловых пластиков(Рисунок 1H,I). Этот метод адаптирует наш ранее описанный подход к культивации первичной ткани белых адипоцитов человека6,7. Затем MPS молочной железы может быть засеяна моделью BC по выбору, начиная от стандартных клеточных линий BC до первичных опухолей молочной железы человека. Здесь мы показываем, что эти BC-MPS стабильны в культуре в течение нескольких недель(рисунок 2); включают нативные элементы HBT, такие как адипоциты молочной железы, ECM, эндотелий, иммунные клетки(рисунок 3); и резюмировать физиологические взаимодействия между БК и ГБТ, такие как метаболические перекрестные помехи(рисунок 4). Наконец, мы показываем, что BC-MPS позволяет изучать амебоидное движение клеток BC по всему HBT(рисунок 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Новые системы моделирования рака молочной железы человека необходимы для лучшего понимания заболевания. Разработка микрофизиологических систем человека для моделирования условий заболевания, которые включают нативные ECM и стромальные клетки, увеличит прогностическую силу доклинич…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core, а также Tulane Histology Core за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана исследовательским грантом Юго-восточного общества пластических и реконструктивных хирургов 2019 года и Национальным научным фондом (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
Riferimenti
- DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
- . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
- Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
- Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
- Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
- Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
- Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
- Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
- Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
- Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
- Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Ricerca sul cancro. 71 (7), 2455-2465 (2011).
- Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
- Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
- Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
- Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
- Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
- Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
- Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
- Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
- Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
- Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
- Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
- Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
- Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
- Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).
