Modelado del cáncer de mama en el tejido mamario humano utilizando un sistema microfisiológico
Summary
Este protocolo describe la construcción de un sistema microfisiológico in vitro para estudiar el cáncer de seno usando el tejido humano primario del pecho con los materiales del estante.
Abstract
El cáncer de mama (BC) sigue siendo una de las principales causas de muerte entre las mujeres. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fracasan en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se necesitan nuevos modelos para mejorar nuestra comprensión de la enfermedad. El programa de sistemas microfisiológicos (MPS) de los NIH se desarrolló para mejorar la traducción clínica de los descubrimientos de la ciencia básica y las nuevas estrategias terapéuticas prometedoras. Aquí presentamos un método para generar las P.M. para los cánceres de seno (BC-MPS). Este modelo adapta un enfoque previamente descrito de cultivo de tejido adiposo blanco humano primario (WAT) intercalando WAT entre las hojas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) s. Los aspectos nuevos de nuestro BC-MPS incluyen la siembra de células bc en el tejido mamario humano no enfermo (HBT) que contiene matriz extracelular nativa, adipocitos maduros, fibroblastos residentes, y las células inmunes; y intercalar la mezcla BC-HBT entre las hojas asc derivadas de HBT. El BC-MPS resultante es estable en cultivo ex vivo durante al menos 14 días. Este sistema modelo contiene múltiples elementos del microambiente que influyen en bc incluyendo adipocitos, células del estroma, células inmunes, y la matriz extracelular. Por lo tanto, BC-MPS se puede utilizar para estudiar las interacciones entre BC y su microambiente.
Demostramos las ventajas de nuestro BC-MPS mediante el estudio de dos comportamientos de BC conocidos por influir en la progresión del cáncer y la metástasis: 1) la motilidad bc y 2) bc-HBT diafonía metabólica. Mientras que la movilidad de BC se ha demostrado previamente usando proyección de imagen intravital, BC-MPS permite la proyección de imagen de alta resolución del lapso de tiempo usando microscopia de la fluorescencia durante varios días. Además, mientras que la diafonía metabólica fue demostrada previamente usando las células de BC y los pre-adipocytes murine distinguidos en adipocytes inmaduros, nuestro modelo de BC-MPS es el primer sistema para demostrar esta diafonía entre los adipocytes mamarios humanos primarios y las células de BC in vitro.
Introduction
Cada año, más de 40.000 mujeres estadounidenses mueren de cáncer de mama (BC)1. A pesar de más de $700 millones invertidos en la investigación de BC anualmente, el 97% de los fármacos candidatos a BC fallan los ensayos clínicos2,3. Se necesitan nuevos modelos para mejorar la cartera de desarrollo de fármacos y nuestra comprensión de BC. El Programa Microfisiológico (MPS) de los NIH delineó las características requeridas para los modelos innovadores para mejorar la traducción de la ciencia básica en éxito clínico4. Éstos incluyeron el uso de células o de tejidos humanos primarios, estables en cultura por 4 semanas, y la inclusión de la arquitectura nativa del tejido y de la respuesta fisiológica.
Los modelos actuales in vitro de BC, como el cultivo bidimensional de líneas celulares de BC, el co-cultivo de inserto de membrana y los esferoides y organoides tridimensionales, no cumplen con los criterios de MPS de los NIH porque ninguno de estos recapitula la arquitectura del tejido mamario nativo. Cuando la matriz extracelular (ECM) se agrega a estos sistemas, el ECM del pecho no se utiliza; en su lugar, se utilizan geles de colágeno y matrices de membrana basal.
Los sistemas in vivo actuales, tales como xenoinjertos derivados pacientes (PDX), semejantemente no resuelven los criterios de la P.M. de nih porque los tejidos mamarios murine diferencian grandemente de pechos humanos. Por otra parte, las interacciones del sistema inmune-BC se reconocen cada vez más como dominantes en el desarrollo del tumor, pero los modelos murine immunocompromised usados para generar tumores de PDX carecen de las células de T maduras, de las células de B, y de las células de asesino naturales. Además, mientras que PDX permite que los tumores primarios del pecho sean mantenidos y ser ampliados, los tumores resultantes de PDX se infiltran con las células murine primarias del estroma y ECM5.
Para superar estos desafíos, hemos desarrollado un nuevo, ex vivo, tridimensional mamario humano MPS que cumple con los criterios de NIH MPS. La base de nuestro MPS mamario se realiza intercalando tejido mamario humano primario (HBT) entre dos láminas de células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), también aisladas de HBT(Figura 1). Los émbolos para transferir las hojas celulares para emparedar el HBT pueden imprimirse en 3D o estar hechos de plásticos acrílicos simples (Figura 1H,I). Esta técnica adapta nuestro enfoque previamente descrito para el cultivo de tejido de adipocitos blancos humanos primarios6,7. El MPS del pecho se puede entonces sembrar por un modelo de BC de la opción, extendiéndose de variedades de células estándar de BC a los tumores humanos primarios del pecho. Aquí, mostramos que estos BC-MPS son estables en cultivo durante varias semanas(Figura 2); incluyen elementos nativos de hbt tales como adipocytes mamarios, ECM, endotelio, células inmunes (Figura 3); y recapitular las interacciones fisiológicas entre BC y HBT como la diafonía metabólica(Figura 4). Por último, mostramos que BC-MPS permite el estudio del movimiento ameboide de las células BC a lo largo de hbt (Figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Se necesitan nuevos sistemas para modelar el cáncer de mama humano a fin de desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad. El desarrollo de sistemas microfisiológicos humanos para modelar los ajustes de la enfermedad que incluyen ecm nativo y las células stromal aumentará el poder profético de estudios preclínicos. El modelo BC-MPS presentado aquí es un sistema de nuevo desarrollo que supera las limitaciones de los modelos anteriores permite la evaluación de BC en su entorno HBT nativo. Este sistema se pued…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo y Clasificación Celular de Tulane, así como al Núcleo de Histología de Tulane por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por la Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant y la National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Materials
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
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