Generación Y Ensamblaje De Nucleocápsides Específicas Del Virus Respiratorio Sincitial
Summary
Para el análisis mecánico profundizado de la síntesis sincitial respiratoria del ARN del virus (RSV), divulgamos un protocolo de utilizar la fosfoproteína de la chaperona (p) para el coexpression de la nucleoproteína ARN-libre (N0)para el montaje in vitro subsecuente de las nucleocápsides virus-específicas (NCs).
Abstract
El uso de una plantilla de ARN auténtica es fundamental para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN viral que puede guiar tanto el descubrimiento mecanicista como el desarrollo de ensayos en virología. La plantilla del ARN de los virus nonsegmented del ARN del negativo-sentido (NNS), tales como el virus sincitial respiratorio (RSV), no es una molécula del ARN solamente sino algo un complejo encapsidated de la ribonucleoprotein de la nucleoproteína (N). A pesar de la importancia de la plantilla auténtica del ARN, la generación y el montaje de tal complejo del ribonucleoprotein siguen siendo sofisticados y requieren la aclaración profundizada. El principal desafío es que el RSV N sobreexpresado se une no específicamente a los ARN celulares para formar partículas aleatorias similares a nucleocáps (NCLPs). Aquí, establecimos un protocolo para obtener N libre de ARN (N0)primero co-expresando N con una fosfoproteína chaperona (P), luego ensamblando N0 con oligos de ARN con la secuencia de ARN específica del RSV para obtener nucleocápsides específicas del virus (NCs). Este protocolo muestra cómo superar la dificultad en la preparación de este complejo viral tradicionalmente desafiando del ribonucleoprotein.
Introduction
Los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) incluyen muchos patógenos humanos significativos, como la rabia, el ébola y el virus sincitial respiratorio (RSV)1,2. El RSV es la principal causa de enfermedades respiratorias como la bronquiolitis y la neumonía en niños pequeños y adultos mayores en todo el mundo3. Actualmente, no hay vacunas efectivas o terapias antivirales disponibles para prevenir o tratar el RSV4. Como parte del ciclo de vida, el genoma del RSV sirve como la plantilla para la replicación por la ARN polimerasa dependiente del ARN del RSV para producir un antigenoma, que a su vez actúa como la plantilla para generar un genoma de progenie. Tanto el genoma como el antigenoma RNAs son totalmente encapsidados por la nucleoproteína (N) para formar las nucleocápsides (NCs)3. Debido a que los CN sirven como plantillas tanto para la replicación como para la transcripción por la ARSV polimerasa, el ensamblaje adecuado de NC es crucial para que la polimerasa obtenga acceso a las plantillas para la síntesis de ARN5. Curiosamente, basándose en los análisis estructurales de las polimerasas virales NNS, se presume que varias proteínas N se disocian transitoriamente de las NCs para permitir el acceso de la polimerasa y reenlazarse al ARN después de la síntesis de ARN6,7,8,9,10,11,12.
Actualmente, el ensayo de polimerización de ARN del RSV se ha establecido utilizando la polimerasa purificada del RSV en plantillas cortas de ARN desnudo13,14. Sin embargo, las actividades de la RSV polimerasa no alcanzan el óptimo, como se observa en los productos no procesivos y abortivos generados por la RSV polimerasa cuando se utilizan plantillas de ARN desnudo. La carencia del NC con el ARN virus-específico es una barrera primaria para la comprensión mecanicista adicional de la síntesis del ARN de RSV. Por lo tanto, el uso de una plantilla de ARN auténtica se convierte en una necesidad crítica para avanzar en el conocimiento fundamental de la síntesis de ARN del RSV. Las estructuras conocidas de las partículas similares a nucleocáps (NCLPs) del RSV y otros virus de ARN del NNS revelan que los ARN en los NCLPs son ARN celulares aleatorios o ARN genómicos virales promedio15,16,17,18,19. Juntos, el principal obstáculo es que N se une no específicamente a los RNAs celulares para formar NCLPs cuando N se sobreexpresa en las células huésped.
Para superar este obstáculo, establecimos un protocolo para obtener primero RNA-libre (N0)y ensamblar N0 con ARN genómico viral auténtico en NCLPs20. El principio de este protocolo es obtener una gran cantidad de N libre de ARN recombinante (N0)coexpresando N con una chaperona, el dominio N-terminal de la fosfoproteína del VSR (PNTD). El N0P purificado podría ser estimulado y ensamblado en NCLPs mediante la adición de oligos de ARN específicos del RSV, y durante el proceso de ensamblaje, la chaperona PNTD se desplaza tras la adición de oligos de ARN.
Aquí, detallamos un protocolo para la generación y el montaje de RSV ARN-específico NCs. En este protocolo, se describe la clonación molecular, la preparación de proteínas, el ensamblaje in vitro y la validación del ensamblaje complejo. Destacamos la estrategia de clonación para generar construcciones bi-cistrónicas para la coexpresión de proteínas para la clonación molecular. Para la preparación de proteínas, se describen los procedimientos de cultivo celular, extracción de proteínas, y la purificación del complejo proteico. A continuación, discutimos el método para el montaje in vitro de los NCs específicos de ARN del RSV. Finalmente, utilizamos la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y la microscopía electrónica de manchas negativas (EM) para caracterizar y visualizar los NCLPs ensamblados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las estructuras conocidas de partículas similares a nucleópsides (NCLP) de los virus de ARN de sentido negativo no segmentado (NNS) muestran que los NCLPs ensamblados son el complejo N con ARN celulares del huésped cuando se sobreexpresan en sistemas de expresión bacterianos o eucariotas15,16,17,18,19. Estudios anteriores han intentado obtener el ARN libre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los programas de investigación en el laboratorio Liang en Emory son apoyados por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Estados Unidos (NIGMS), los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número de premio R01GM130950 y el Fondo de Investigación inicial de la Facultad de Medicina de la Universidad de Emory. El autor reconoce a los miembros del laboratorio de Liang por su apoyo útil y su discusión crítica.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
Riferimenti
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