Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

Summary

Qui presentiamo un protocollo che dimostra la tecnica e i controlli necessari per l’imaging perfusione Laser Doppler per misurare il flusso sanguigno nell’arto posteriore del topo.

Abstract

Il recupero del flusso sanguigno è una misura critica del risultato dopo ischemia hindlimb sperimentale o ischemia-riperfusione. L’imaging perfusione Laser Doppler (LDPI) è un metodo comune, non invasivo e ripetibile per valutare il recupero del flusso sanguigno. La tecnica calcola il flusso sanguigno complessivo nel tessuto campionato dallo spostamento doppler della frequenza causato quando un laser colpisce i globuli rossi in movimento. Le misurazioni sono espresse in unità di perfusione arbitrarie, quindi il controfilettale non intervenuto sulla gamba viene solitamente utilizzato per aiutare a controllare le misurazioni. La profondità di misura è dell’intervallo di 0,3-1 mm; per l’ischemia dell’arto posteriore, ciò significa che viene valutata la perfusione dermica. La perfusione dermica dipende da diversi fattori, in particolare la temperatura cutanea e l’agente anestetico, che devono essere attentamente controllati per ottenere letture affidabili. Inoltre, la pigmentazione dei capelli e della pelle può alterare la capacità del laser di raggiungere o penetrare nel derma. In questo articolo viene illustrata la tecnica dell’LDPI nell’hindlimb del mouse.

Introduction

L’ulcerazione cutanea con una guarigione inadeguata delle ferite è una delle principali cause di amputazioni nei pazienti umani¹. Un’adeguata guarigione delle ferite richiede livelli di perfusione arteriosa più elevati di quelli necessari per mantenere intatta la pelle, che è compromessa nei pazienti con malattia arteriosa periferica^2,3,4. Molte altre condizioni reumatologiche e diabete possono anche portare a microcircolo cutaneo disturbato e inadeguato per guarire le^{ferite 5,6}. Molti pazienti diabetici hanno una concomitante malattia arteriosa periferica, mettendoli a rischio particolarmente elevato di amputazione. L’imaging perfusione Laser Doppler (LDPI) viene utilizzato in situazioni cliniche per valutare il microcircolo cutaneo, nonché in situazioni di ricerca per valutare il flusso sanguigno e il recupero del flusso sanguigno dopo ischemia hindlimb sperimentale, ischemia-riperfusione e lembi microchirurgici⁷.

Il sistema LDPI proietta un raggio laser a bassa potenza che viene deviato da uno specchio di scansione per muoversi su una regione di interesse. Questo differisce dalla fluidmetria Laser Doppler, che fornisce una misurazione perfusione per la piccola area del tessuto a diretto contatto con la sonda di^{flussometria 8}. Quando il raggio laser interagisce con il sangue in movimento nella microvascolarizzazione, subisce uno spostamento di frequenza Doppler, che viene fotodetratto dallo scanner e convertito in unità di perfusione arbitrarie. Poiché l’LDPI è una tecnica leggera, è limitata in termini di profondità di penetrazione a 0,3-1 mm, il che significa che per la maggior parte la perfusione dermica viene^{valutata 7}. Il flusso dermico può essere alterato dalla temperatura della pelle e dal sistema nervoso simpatico, che può essere influenzato da vari agenti anestetici⁹. Le misurazioni dal laser ottico sono influenzate anche dalle condizioni di illuminazione ambientale, dalla pigmentazione della pelle e possono essere bloccate sovrascriendo pelliccia o capelli⁷.

LDPI è la tecnica di ricerca più comunemente utilizzata per monitorare il recupero della perfusione dopo l’ischemia perché non invasiva, non richiede la somministrazione del contrasto e ha tempi di scansione rapidi che consentono la raccolta dei dati su più animali. Questo lo rende ideale per aiutare a determinare se i trattamenti mirati all’arteriogenesi terapeutica o all’angiogenesi sono efficaci nei piccoli modelli animali. Il recupero del flusso sanguigno dopo l’ischemia dell’arto posteriore misurato dall’LDPI è ben correlato con lo sviluppo collaterale dell’arteria se valutato con altri mezzi come la fusione di Microfil o la micro-TC^10,11. L’obiettivo di questo protocollo è dimostrare la valutazione della perfusione dell’ostacolo utilizzando l’LDPI.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università di Washington. 1. Preparazione dello scanner Regolare l’altezza dello scanner in modo che la distanza dal soggetto scansionato sia di circa 30 cm. Accendere l’imager e avviare il software associato. Aprire il programma di misurazione. Se il software comunica correttamente con lo scanner, verrà visuali…

Representative Results

Il successo dell’LDPI dovrebbe comportare scansioni coerenti ripetute, con non più di 100-150 variazioni dell’unità di perfusione (corrispondenti a circa il 10% della perfusione media abituale per il pedano del mouse) tra le tre scansioni(Figura 2). Come illustrato nella figura 2, le scansioni ripetute aiutano a determinare che il mouse è stato opportunamente equilibrato in modo che il rapporto ischemico/controllo rifletta al meglio il flusso sanguigno sottos…

Discussion

Una tecnica coerente è fondamentale per ottenere risultati affidabili con LDPI. Lo stesso anestetico, le impostazioni di temperatura, la posizione del mouse e l’area di interesse devono essere utilizzati durante l’intero corso del tempo. Diversi agenti anestetici si tradurranno in valori di perfusione più o meno^{elevati 9}. L’anestesia isoflurana è conveniente a causa della sua rapida insorgenza ed emergenza, nonché della sicurezza generale. Una percentuale costante di isoflurane deve essere uti…

Materials

Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors