DNA 후광 제제와 형광 in situ 하이브리드화를 결합하면 뉴클레오스켈레톤과의 게놈 상호작용에 대한 고분해능 분석이 가능합니다. 부착된 게놈은 추출된 잔류 핵 내에 위치한 혼성화된 형광 신호를 유도하는 반면, 부착되지 않은 게놈은 잔류 핵을 둘러싸고 있는 DNA의 후광에 있습니다.
게놈은 활동을 조절하고 특정 위치에 고정하기 위해 세포핵 내부의 여러 구조와 관련이 있습니다. 이러한 구조는 총칭하여 핵골격으로 알려져 있으며 핵층, 핵소체 및 핵체를 포함합니다. 게놈과 그 조직을 연구하기 위해 형광 FISH(Fluorescence in situ hybridization)의 많은 변이체가 존재하지만, 이들은 종종 분해능에 의해 제한되고 게놈과 핵 구조의 연관성에 대한 정보가 충분하지 않습니다. DNA 헤일로 방법은 높은 염분 농도와 비이온성 세제를 사용하여 게놈 내의 부착 영역을 통해 핵 내 구조에 고정된 상태로 유지되는 DNA 루프를 생성합니다. 여기에서 히스톤, 지질 및 핵 매트릭스에 단단히 결합되지 않은 DNA와 같은 가용성 핵 단백질이 추출됩니다. 이것은 내부 핵 구조 및 추출 저항성 단백질과 밀접하게 관련된 DNA를 포함하는 잔류 핵을 둘러싼 부착되지 않은 DNA의 후광을 형성합니다. 이러한 확장된 DNA 가닥은 분해능을 높이고 물리적 매핑을 용이하게 할 수 있습니다. FISH와 함께 이 방법은 게놈이 고정되어 있는 모든 구조와의 게놈 상호 작용을 연구하는 추가 이점이 있습니다. HALO-FISH라고 하는 이 기술은 DNA 후광을 핵산 프로브와 결합하여 유전자좌, 전체 염색체, 알파 위성, 텔로미어 및 RNA까지 밝혀낼 수 있는 매우 다재다능합니다. 이 기술은 정상 세포와 암과 같은 질병 진행에서 핵 조직과 기능에 대한 통찰력을 제공합니다.
“핵 매트릭스”는 19741에서 Berezney와 Coffey에 의해 처음 기술되었습니다. 쥐의 간 핵에 대해 높은 염분 몰 농도와 뉴클레아제 처리로 추출을 수행한 후, 그들은 단백질성 구조 프레임워크를 확인했습니다. DNA 후광 절차는 이후에 이 방법에서 채택되었으며 가용성 단백질을 제거하여 핵 매트릭스(NM) 및 NM 관련 단백질 및 염색체만 지속되도록 합니다. DNA 부착 영역은 DNA 루프의 기저부에 위치하며 매트릭스 부착 영역(MAR) 또는 스캐폴드 부착 영역(SAR)이라고 하며, 각각 고염 농도 및 이온 세제 리튬-3,5-디요오도살리실레이트(LIS)를 사용한 추출에 내성이 있습니다. DNA 후광에서 MAR/SAR과 관련된 DNA는 잔류 핵 내에 결합되어 있는 반면 DNA 루프는 이러한 부위에서 멀리 확장되어 DNA 후광을 형성합니다. 우리는 이제 게놈이 라미나 관련 도메인(LAD)을 통해 핵층과 핵층 관련 영역(NAD)을 통해 그리고 아마도 특정 핵체와 같은 다른 핵 구조를 통해 고정된다는 것을 알고 있습니다.
DNA 후광 방법은 염색질에서 히스톤이 제거되고 DNA가 2,3,4,5,6으로 늘어나기 때문에 확장된 DNA와 염색질이 더 큰 분해능을 제공하기 때문에 DNA, 유전자 및 염색체 영역의 물리적 매핑에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 응용 프로그램에 DNA 후광을 사용할 때 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, DNA 후광의 잔류 핵과 밀접하게 관련된 DNA는 프로브에 접근할 수 없어 분석 및 물리적 매핑에서 제외될 수 있다6. fiber-FISH 2,4,5,7 및 분자 빗질(molecular combining)8과 같은 다른 기술들 또한 물리적 맵핑을 가능하게 하고, 비교적 빠르고 쉽게 수행할 수 있다는 장점을 갖는다. 둘 다 DNA 후광에 대한 유전자의 DNA 매핑에 우선적으로 사용됩니다. 이러한 방법은 핵에서 용매 또는 염 추출을 사용하여 염색질 섬유를 추출하지만 분자 빗질은 더 나은 재현성을 갖는 경향이 있습니다 8,9.
뉴클레오스켈레톤이 DNA의 부착 부위, 염색질 리모델링, DNA 전사, DNA 복구 및 DNA 복제와 같은 주요 핵 과정을 지원하는 역할을 한다는 증거가 증가하고 있습니다11,12. 따라서 DNA 후광 기술은 이러한 세포 활동 동안 뉴클레오스켈레톤과 게놈 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 개발되었으며 연구에서 일상적으로 사용 및 보고되었습니다. 이 기술은 또한 질병 진행과 관련하여 게놈과 뉴클레오스켈레톤 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되었으며 핵 구조의 악성 종양 관련 변화가 확인되었습니다11.
DNA 후광 기술은 또한 발달과 분화 과정에서 게놈과 뉴클레오스켈레톤 사이의 관계를 조사하는 데 사용되었다12. 많은 연구에서 FISH14와 결합된 경우 halosperm13 또는 SpermHalo-FISH로 알려진 DNA 후광 기술의 변형을 사용했습니다. 정자 염색질은 프로타민으로 알려진 단백질에 밀접하게 결합되어 있으며 이 기술은 정자 DNA에 대한 접근성을 향상시키기 위해 개발되었습니다. 연씨식물은 정자 DNA의 무결성을 조사하고 DNA 손상이 있는지 확인하는 데 사용되었습니다. DNA 손상이 적은 정자는 더 큰 DNA 후광 크기와 관련이 있는 반면, 파편화되고 손상된 DNA 수준이 증가한 정자는 후광이 작거나 전혀 없었습니다. 따라서 염씨식물은 IVF를 통한 배아의 질과 성공적인 임신의 잠재적인 예후 마커로 사용될 수 있습니다13. 이 예는 이 기술의 잠재적인 임상 적용을 강조합니다. 우리의 연구에서 우리는 HALO-FISH를 사용하여 게놈 행동의 변화와 조기 노화 질환 인 허친슨-길 포드 (Hutchinson-Gilford) Progeria 증후군 (HGPS)에서 특정 약물 치료의 효과를 평가했습니다 15.
이러한 연구와 다른 연구를 함께 사용하면 DNA 후광 기술을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로세스/응용 프로그램의 폭과 기술의 유용성을 강조합니다.
DNA 후광 방법은 뉴클레오스켈레톤과 게놈 간의 상호 작용을 분석할 때 선택하는 훌륭한 방법이지만 준수해야 하는 몇 가지 중요한 단계도 있습니다. 가장 중요한 매개 변수 중 하나는 세포 파종 밀도의 최적화입니다. 세포가 과도하게 융합되면 DNA 후광이 이웃 세포와 겹쳐 분석을 수행할 수 없게 됩니다. CSK 및 추출 완충액은 생물학적 활성을 유지하기 위해 준비 과정이 끝날 때 추출 완충액에 스페르민, 스페르미딘 및 디지토닌을 첨가하여 사용 당일에 항상 신선하게 만들어야 합니다. Halo-FISH를 수행하는 경우 DNA 후광의 정확한 변성 온도를 사용하여 프로브 또는 페인트가 이후에 혼성화될 수 있도록 하는 것이 매우 중요합니다.
전자 현미경은 필라멘트 구조가 확인된 핵 매트릭스를 시각화하는 데 사용되어 왔다20. 그러나 전자 현미경은 염색질과의 매트릭스 연관성을 쉽게 추론할 수 없기 때문에 제한적입니다. 실제로 DNA Halo 방법은 특정 유전자, 염색체 및 세포 상태를 모두 검사할 수 있기 때문에 전자 현미경에 비해 더 다재다능합니다. 또한, 핵 매트릭스 단백질의 단백질체 분석이 연구되고 있다21,22. 이 방법은 특히 병든 세포를 비교할 때 핵 매트릭스 구성 요소를 비교하는 데 유용하지만 표준 DNA Halo 기술로 강조된 공간 분포 및 부착을 제공하지 않습니다.
DNA Halo 분석에는 한계가 있습니다. 첫째, 매트릭스가 추출될 때 고정된 세포에서만 수행할 수 있으므로 라이브 이미징이 불가능합니다. DNA Halo 방법은 비교적 빠르고 쉽게 수행할 수 있지만 세포 배양, 프로브 생성, Halo-FISH 및 분석을 모두 고려할 때 전체 프로세스에 시간이 많이 소요될 수 있습니다.
초해상도 현미경을 사용한 DNA Halos 및 HALO-FISH의 이미지 캡처는 DNA 특이적 프로브 및 항체의 해상도를 크게 향상시킬 것입니다. 또한, 형광색소는 스펙트럼으로 더 쉽게 분리될 수 있기 때문에 단일 실험에서 많은 DNA 프로브를 사용하여 더 많은 정보를 제공할 수 있습니다. 염색체 형태 포획(3C)과 같은 분자 생물학 기술의 개선은 유전자좌의 상호 작용을 결정하고 세포의 염색질에 대한 공간 조직을 분석하는 데 사용되었습니다. DNA 헤일로 분석과 3C를 결합할 수 있으며, 이는 M3C23으로 알려진 용어로, DNA 헤일로 기술의 적응성을 다시 보여줍니다.
여기에 제시된 원본 데이터는 게놈 행동 조사의 가능성과 이러한 데이터를 제시하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 이러한 데이터를 통해 우리는 (1) 염색체 페인팅 프로브를 사용하여 게놈 부착의 유의미한 차이를 결정할 수 있음을 입증했으며, 이 연구에서 18번 염색체가 분석된 염색체 중 가장 적게 부착된 염색체임을 밝혔습니다(그림 3). (2) 두 유전자좌 사이에 상당한 차이가 있는 유전자좌(그림 4) (3) 증식 및 노화 세포에 비해 정지 세포에서 덜 강하게 부착되는 텔로미어(그림 5). 우리는 불용성 단백질인 증식 마커 Ki67 항원의 존재를 통해 증식 세포와 비증식 세포를 구별할 수 있으며, 이는 잔류 핵과 함께 남아 있거나 특정 기간 내에 S상을 통과한 세포를 강조하기 위해 뉴클레오티드의 결합을 사용합니다(그림 2). 이 기술을 통해 우리는 핵골격, 즉 laminopathy 세포에서 손상된 세포의 게놈 거동을 분석 할 수 있었으며 Bikkul et al., 2018 우리는 게놈이 대조군 세포와 비교할 때 덜 밀접하게 부착 될 수 있으며 고전적인 HGPS 세포에서 lamin A 돌연변이의 효과를 개선하는 특정 약물로 치료할 때 회복 될 수 있음을 밝혔습니다15. 그러나, 우리는 라민 A 돌연변이가 없지만 염색체 13이 덜 밀접하게 부착되어있는 LINC 복합체 단백질 SUN19 1의 특이한 형태를 포함하는 비정형 HGPS AGO8466 세포에 대한 새로운 데이터를 보여준다 (그림 6).
HALO-FISH는 추출 절차에서 제거되지 않은 단백질을 분해하기 위해 간접 면역형광과 함께 뉴클레오스켈레톤과의 게놈 상호작용 연구를 가능하게 하는 독특한 방법입니다. 뉴클레오스켈레톤은 특정 암 유형19과 같은 다양한 질병에서 변형되고 진단 바이오마커로서 일부 뉴클레오스켈레톤 관련 단백질의 중요성이 입증되었습니다24,25. 따라서, 이 기술은 질병 15,24,25,27에서 염색질 조직/해체에 대한 뉴클레오스켈레톤의 효과를 조사 하는 데 중요한 역할을 하며, 인간 세포에 국한되지 않고, 다른 동물의 염색체 페인팅 프로브를 사용하여 동일한 DNA-후광 프로토콜을 사용할 수 있다 28.
The authors have nothing to disclose.
염색체 팔 페인팅 프로브의 친절한 선물에 대해 Michael Bittner 교수에게 감사드립니다. LG는 EU가 자금을 지원하는 EURO-Laminopathies 프로젝트와 Brunel Progeria Research Fund의 지원을 받았습니다.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |