Kombinering av DNA-halopreparater med fluorescens in situ-hybridisering muliggjør høyoppløselig analyse av genomiske interaksjoner med nukleoskeletonet. Vedlagt genom fører til hybridiserte fluorescerende signaler lokalisert i de gjenværende ekstraherte kjernene, mens ikke-festet genom er i haloen av DNA som omgir de resterende kjernene.
Genomet er forbundet med flere strukturer inne i cellekjerner, for å regulere aktiviteten og forankre den på bestemte steder. Disse strukturene er kollektivt kjent som nukleoskeleton og inkluderer kjernefysiske lamina, nukleolene og kjernelegemene. Selv om mange varianter av fluorescens in situ hybridisering (FISH) eksisterer for å studere genomet og dets organisasjon, er disse ofte begrenset av oppløsning og gir utilstrekkelig informasjon om genomets tilknytning til kjernefysiske strukturer. DNA-halo-metoden bruker høye saltkonsentrasjoner og ikke-ioniske vaskemidler for å generere DNA-sløyfer som forblir forankret til strukturer i kjerner gjennom festeområder i genomet. Her ekstraheres løselige nukleære proteiner, som histoner, lipider og DNA som ikke er tett bundet til den nukleære matrisen. Dette fører til dannelsen av en halo av ufestet DNA som omgir en gjenværende kjerne som i seg selv inneholder DNA nært forbundet med interne kjernefysiske strukturer og ekstraksjonsresistente proteiner. Disse utvidede DNA-strengene muliggjør økt oppløsning og kan lette fysisk kartlegging. I kombinasjon med FISH har denne metoden den ekstra fordelen av å studere genomiske interaksjoner med alle strukturer som genomet er forankret av. Denne teknikken, kalt HALO-FISH, er svært allsidig der DNA-haloer kan kombineres med nukleinsyreprober for å avsløre genloci, hele kromosomer, alfa-satellitt, telomerer og til og med RNA. Denne teknikken gir et innblikk i nukleær organisasjon og funksjon i normale celler og i sykdomsprogresjon som med kreft.
Den “kjernefysiske matrisen” ble først beskrevet av Berezney og Coffey i 19741. Etter å ha utført ekstraksjoner med høye saltmolariteter og nukleasebehandling på rotteleverkjerner, identifiserte de et proteinholdig strukturelt rammeverk. DNA-halo-prosedyren ble senere tilpasset fra denne metoden og innebærer fjerning av løselige proteiner slik at bare kjernematrisen (NM) og NM-assosierte proteiner og kromosomer vedvarer. DNA-vedleggsregioner ligger ved basen av DNA-sløyfer og kalles matriksfestede regioner (MAR) eller stillasfesteregioner (SAR), som er resistente mot ekstraksjon med henholdsvis høye saltkonsentrasjoner og ionisk vaskemiddel litium-3,5-diiodosalisylat (LIS). I DNA-haloer er DNA assosiert med MARs / SARs bundet i den gjenværende kjernen, mens DNA-sløyfene strekker seg bort fra disse stedene og danner DNA-haloen. Vi vet nå at genomet er forankret via lamina assosierte domener (LADs) til kjernelamina og gjennom nukleolære assosierte regioner (NADs) og muligens gjennom andre kjernefysiske strukturer som spesifikke kjernelegemer.
DNA-halo-metoden kan brukes til fysisk kartlegging av DNA, gener og kromosomale regioner, da det utvidede DNA og kromatin gir en større oppløsning fordi kromatinet er strippet for histoner og DNA er strukket ut 2,3,4,5,6. Det er imidlertid noen begrensninger når du bruker DNA-haloer for denne applikasjonen. For eksempel kan DNA tett forbundet med gjenværende kjerner av DNA-haloer være utilgjengelig for prober, og dermed utelukke det fra analyse og fysisk kartlegging6. Andre teknikker som fiber-FISH 2,4,5,7 og molekylær kaming 8 muliggjør også fysisk kartlegging og har fordelen av å være relativt rask og enkel å utføre. Begge brukes fortrinnsvis til DNA-kartlegging av gener over DNA-haloer. Disse metodene ekstraherer kromatinfibre ved bruk av løsningsmiddel eller saltekstraksjoner fra kjernen, men molekylær kaming har en tendens til å ha bedre reproduserbarhet 8,9.
Det er et økende bevis på at nukleoskjelettet har en rolle i å støtte viktige kjernefysiske prosesser, for eksempel festesteder for DNA, kromatinremodellering, DNA-transkripsjon, DNA-reparasjon og DNA-replikasjon11,12. Som sådan ble DNA-haloteknikken utviklet for å undersøke samspillet mellom nukleoskjelettet og genomet under disse cellulære aktivitetene, og har blitt rutinemessig brukt og rapportert i forskning. Denne teknikken har også blitt brukt til å undersøke interaksjoner mellom genomet og nukleoskjelettet i forhold til sykdomsprogresjon med malignitetsassosierte endringer i nukleær struktur som blir identifisert11.
DNA-glorieteknikken har også blitt brukt til å undersøke forholdet mellom genomet og nukleoskeleton under utvikling og differensiering12. En rekke studier har brukt en variant av DNA-haloteknikken kjent som halosperm13 eller SpermHalo-FISH hvis kombinert med FISH14. Spermatozoakromatin er tett bundet til proteiner kjent som protaminer, og denne teknikken ble utviklet for å forbedre tilgangen til sædens DNA. Halosperm har blitt brukt til å undersøke integriteten til spermatozoa DNA og avgjøre om DNA-skade er tilstede. Spermatozoa med mindre DNA-skade korrelerer med en større DNA-halostørrelse, mens spermatozoa med økte nivåer av fragmentert og skadet DNA hadde enten små haloer eller ingen i det hele tatt. Dermed kan halosperm brukes som en potensiell prognostisk markør for embryokvalitet og vellykket graviditet med IVF13. Dette eksemplet understreker de potensielle kliniske anvendelsene av denne teknikken. I vårt arbeid har vi brukt HALO-FISH til å vurdere endringer i genomatferd og effekten av spesifikke medikamentelle behandlinger ved den premature aldringssykdommen Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS)15.
Sammen belyser disse, og andre studier, bredden av prosesser/applikasjoner som DNA-glorieteknikken kan brukes til å studere og bruken av teknikken.
DNA-halo-metoden er en utmerket metode for valg når man analyserer interaksjoner mellom nukleoskeleton og genom, men det er noen kritiske trinn som også må overholdes. En av de viktigste parametrene er optimalisering av cellesåingstettheten. Hvis celler blir overflytende, vil DNA-haloene overlappe med naboceller, noe som gjør det umulig å utføre analysen. CSK og ekstraksjonsbufferne må alltid gjøres ferske på bruksdagen med spermin, spermidin og digitonin tilsatt ekstraksjonsbufferen ved slutten av preparatprosessen for å opprettholde sin biologiske aktivitet. Hvis du utfører Halo-FISH, er det ekstremt viktig å bruke riktig denatureringstemperatur på DNA-haloene slik at sonden eller malingen deretter kan hybridisere.
Elektronmikroskopi har blitt brukt til å visualisere den nukleære matrisen, med trådformede strukturer som blir identifisert20. Imidlertid er elektronmikroskopi begrenset da matriseforeninger med kromatin ikke lett kan utledes. Faktisk er DNA Halo-metoden mer allsidig sammenlignet med elektronmikroskopi, da spesifikke gener, kromosomer og celletilstander alle kan undersøkes. Videre studeres proteomisk analyse av nukleære matriksproteiner21,22. Denne metoden er god for å sammenligne kjernefysiske matrisekomponenter, spesielt når man sammenligner syke celler, men den gir ikke den romlige fordelingen og vedleggene som er fremhevet av standard DNA Halo-teknikken.
DNA Halo-analyser har begrensninger. For det første, ettersom matrisen ekstraheres, kan dette bare utføres på faste celler, slik at levende avbildning ikke er mulig. Selv om DNA Halo-metoden er relativt rask og enkel å utføre, kan den totale prosessen være tidkrevende når cellekultur, sondegenerering, Halo-FISH og analyse tas i betraktning.
Bildeopptak av DNA, haloer og HALO-FISH ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi vil forbedre oppløsningen av DNA-spesifikke prober og antistoffer. I tillegg, da fluorokromer lettere kan løses spektralt, kan det være mulig å bruke en rekke DNA-prober i et enkelt eksperiment, noe som gir enda mer informasjon. Forbedringer i molekylærbiologiske teknikker som kromosomkonformasjonsfangst (3C) har blitt brukt til å bestemme interaksjoner av genloci og analysere den romlige organisasjonen på kromatin i cellen. DNA Halo-analyser og 3C kan kombineres, et begrep kjent som M3C23, som igjen demonstrerer tilpasningsevnen til DNA Halo-teknikken.
De opprinnelige dataene som presenteres her er for å demonstrere mulighetene for genomadferd, forhør og hvordan man presenterer disse dataene. Med disse dataene har vi vist at det er mulig å bestemme signifikante forskjeller i genomtilknytning ved hjelp av (1) kromosommalingsprober, i denne studien som viser at kromosom 18 er det minst festede kromosomet av de analyserte (figur 3); (2) Genloci med signifikante forskjeller mellom to genloci og (figur 4) (3) telomerer, som er mindre sterkt festet i hvileceller sammenlignet med prolifererende og senescent celler (figur 5). Vi er i stand til å skille mellom prolifererende og ikke-prolifererende celler via tilstedeværelsen av proliferasjonsmarkøren Ki67-antigenet, som er et uoppløselig protein, så forblir med de resterende kjernene eller ved å bruke inkorporering av nukleotider for å markere celler som har vært gjennom S-fase innenfor en bestemt tidsperiode (figur 2). Denne teknikken har også gjort det mulig for oss å analysere genomoppførsel i celler som er kompromittert i deres nukleoskeletoner, dvs. laminopaticeller, og her og i Bikkul et al., 2018 avslører vi at genomet kan være mindre tett festet sammenlignet med kontrollceller og kan gjenopprettes ved behandling med spesifikke legemidler som forbedrer effekten av lamin A-mutasjonen i klassiske HGPS-celler15. Vi viser imidlertid nye data her for de atypiske HGPS AGO8466-cellene, som mangler en lamin A-mutasjon, men som inneholder en uvanlig form av LINC-kompleksproteinet SUN1 19 som kromosom13 er mindre tett festet i (figur 6).
HALO-FISH er en unik metode som gjør det mulig å studere genomiske interaksjoner med nukleoskjelettet i kombinasjon med indirekte immunfluorescens for å løse proteiner som ikke er fjernet fra ekstraksjonsprosedyren. Det er vist at nukleoskjelettet er modifisert ved ulike sykdommer som visse krefttyper19 og betydningen av noen nukleoskeletonassosierte proteiner som diagnostiske biomarkører24,25. Dermed har denne teknikken en viktig rolle i å undersøke effekten av nukleoskeleton på kromatinorganisering / disorganisering i sykdom 15,24,25,27 og er ikke begrenset til humane celler, med kromosomale malingsprober fra andre dyr, kan den samme DNA-halo-protokollen brukes 28.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke professor Michael Bittner for den vennlige gaven av kromosomarmmalingssonder. LG ble støttet av EU-finansierte EURO-Laminopathies prosjektet og Brunel Progeria Research Fund.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |