Сочетание препаратов ДНК-гало с флуоресцентной гибридизацией in situ позволяет проводить анализ геномных взаимодействий с нуклеоскелетом с высоким разрешением. Присоединенный геном приводит к гибридизованным флуоресцентным сигналам, расположенным внутри остаточных экстрагированных ядер, тогда как неприсоединенный геном находится в ореоле ДНК, окружающем остаточные ядра.
Геном связан с несколькими структурами внутри клеточных ядер, чтобы регулировать его активность и закреплять его в определенных местах. Эти структуры в совокупности известны как нуклеоскелет и включают ядерную пластинку, ядрышки и ядерные тела. Хотя существует множество вариантов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для изучения генома и его организации, они часто ограничены разрешением и предоставляют недостаточную информацию о связи генома с ядерными структурами. Метод гало ДНК использует высокие концентрации соли и неионогенные детергенты для создания петель ДНК, которые остаются привязанными к структурам внутри ядер через области прикрепления в геноме. Здесь извлекаются растворимые ядерные белки, такие как гистоны, липиды и ДНК, не тесно связанные с ядерным матриксом. Это приводит к образованию ореола неприсоединенной ДНК, окружающей остаточное ядро, которое само содержит ДНК, тесно связанную с внутренними ядерными структурами и устойчивыми к экстракции белками. Эти расширенные нити ДНК обеспечивают повышенное разрешение и могут облегчить физическое картирование. В сочетании с FISH этот метод имеет дополнительное преимущество, заключающееся в изучении геномных взаимодействий со всеми структурами, которыми привязан геном. Этот метод, называемый HALO-FISH, очень универсален, благодаря чему ореолы ДНК могут быть объединены с зондами нуклеиновых кислот для выявления локусов генов, целых хромосом, альфа-сателлитов, теломер и даже РНК. Этот метод дает представление о ядерной организации и функционировании в нормальных клетках и при прогрессировании заболевания, например, при раке.
«Ядерная матрица» была впервые описана Березни и Коффи в 1974 году1. После выполнения экстракции с высоким содержанием соли и обработки нуклеазами ядер печени крыс они идентифицировали белковый структурный каркас. Процедура гало ДНК была впоследствии адаптирована из этого метода и включает удаление растворимых белков таким образом, чтобы сохранялись только ядерный матрикс (NM) и NM-ассоциированные белки и хромосомы. Области прикрепления ДНК расположены у основания петель ДНК и называются областями, присоединенными к матрице (MAR) или областями прикрепления каркаса (SAR), которые устойчивы к экстракции с высокими концентрациями соли и ионным детергентом литий-3,5-дийодосалицилатом (LIS) соответственно. В ореолах ДНК ДНК, связанная с MAR / SAR, связана в остаточном ядре, тогда как петли ДНК простираются от этих участков и образуют ореол ДНК. Теперь мы знаем, что геном привязан через пластинчатые ассоциированные домены (LAD) к ядерной пластинке и через ядрышкоассоциированные области (NAD) и, возможно, через другие ядерные структуры, такие как специфические ядерные тела.
Метод гало ДНК можно использовать для физического картирования ДНК, генов и хромосомных областей, поскольку расширенная ДНК и хроматин обеспечивают большее разрешение, поскольку хроматин лишен гистонов, а ДНК растягивается 2,3,4,5,6. Однако существуют некоторые ограничения при использовании ореолов ДНК для этого приложения. Например, ДНК, тесно связанная с остаточными ядрами ореолов ДНК, может быть недоступна для зондов, что исключает ее из анализа и физического картирования6. Другие методы, такие как fiber-FISH 2,4,5,7 и молекулярное расчесывание 8, также позволяют проводить физическое картирование и имеют то преимущество, что они относительно быстры и просты в выполнении. Оба предпочтительно используются для картирования ДНК генов, а не ореолов ДНК. Эти методы извлекают волокна хроматина с помощью растворителя или солевой экстракции из ядра, однако молекулярное расчесывание, как правило, имеет лучшую воспроизводимость 8,9.
Появляется все больше доказательств того, что нуклеоскелет играет роль в поддержке ключевых ядерных процессов, таких как сайты прикрепления ДНК, ремоделирование хроматина, транскрипция ДНК, репарация ДНК и репликация ДНК11,12. Таким образом, метод гало ДНК был разработан для исследования взаимодействия между нуклеоскелетом и геномом во время этих клеточных активностей и регулярно использовался и освещался в исследованиях. Этот метод также использовался для исследования взаимодействия между геномом и нуклеоскелетом в связи с прогрессированием заболевания с идентификацией связанных со злокачественными новообразованиями изменений в структуре ядра11.
Метод гало ДНК также использовался для исследования взаимосвязи между геномом и нуклеоскелетом во время развития и дифференцировки12. В ряде исследований использовался вариант метода ореола ДНК, известный как галосперм13 или SpermHalo-FISH, в сочетании с FISH14. Хроматин сперматозоидов тесно связан с белками, известными как протамины, и этот метод был разработан для улучшения доступа к ДНК сперматозоидов. Галосперм использовался для исследования целостности ДНК сперматозоидов и определения наличия повреждений ДНК. Сперматозоиды с меньшим повреждением ДНК коррелируют с большим размером ореола ДНК, тогда как сперматозоиды с повышенным уровнем фрагментированной и поврежденной ДНК имели либо небольшие ореолы, либо вообще не имели их. Таким образом, галосперм может быть использован в качестве потенциального прогностического маркера качества эмбриона и успешной беременности при ЭКО13. Этот пример подчеркивает потенциальное клиническое применение этого метода. В нашей работе мы использовали HALO-FISH для оценки изменений в поведении генома и влияния специфических лекарственных препаратов на болезнь преждевременного старения Синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда (HGPS)15.
Вместе эти и другие исследования подчеркивают широту процессов / приложений, для изучения которых может быть использован метод гало ДНК, и полезность этого метода.
Метод ореола ДНК является отличным методом выбора при анализе взаимодействия между нуклеоскелетом и геномом, однако есть некоторые важные шаги, которые также необходимо соблюдать. Одним из важнейших параметров является оптимизация плотности засева клеток. Если клетки станут более сливающимися, то ореолы ДНК будут перекрываться с соседними клетками, что сделает невозможным выполнение анализа. ЦСК и экстракционные буферы всегда должны быть свежими в день использования, при этом спермин, спермидин и дигитонин добавляются в экстракционный буфер в конце процесса приготовления для поддержания их биологической активности. При выполнении Halo-FISH чрезвычайно важно использовать правильную температуру денатурации ореолов ДНК, чтобы зонд или краска впоследствии гибридизировались.
Электронная микроскопия была использована для визуализации ядерной матрицы, при этом нитевидные структуры были идентифицированы20. Однако электронная микроскопия ограничена, так как матричные ассоциации с хроматином не могут быть легко выведены. Действительно, метод DNA Halo более универсален по сравнению с электронной микроскопией, поскольку можно исследовать определенные гены, хромосомы и состояния клеток. Кроме того, изучается протеомный анализ белков ядерного матрикса21,22. Этот метод хорош для сравнения компонентов ядерного матрикса, особенно при сравнении больных клеток, однако он не обеспечивает пространственного распределения и прикреплений, выделенных стандартным методом ДНК Halo.
Анализы ДНК Halo имеют ограничения. Во-первых, поскольку матрица извлекается, это может быть выполнено только на фиксированных клетках, поэтому визуализация в реальном времени невозможна. Несмотря на то, что метод DNA Halo относительно быстр и прост в исполнении, общий процесс может занять много времени, если принять во внимание культуру клеток, генерацию зондов, Halo-FISH и анализ.
Захват изображений ДНК Halos и HALO-FISH с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения значительно улучшит разрешение ДНК-специфических зондов и антител. Кроме того, поскольку флуорохромы могут быть более легко спектрально разрешены, можно использовать несколько зондов ДНК в одном эксперименте, предоставляя еще больше информации. Усовершенствования в методах молекулярной биологии, такие как захват конформации хромосом (3C), были использованы для определения взаимодействий локусов генов и анализа пространственной организации хроматина в клетке. Анализы ДНК Halo и 3C могут быть объединены, термин, известный как M3C23, что еще раз демонстрирует адаптивность метода DNA Halo.
Исходные данные, представленные здесь, предназначены для демонстрации возможностей опроса поведения генома и того, как представить эти данные. С помощью этих данных мы продемонстрировали, что можно определить значительные различия в прикреплении генома с помощью (1) зондов для рисования хромосом, в этом исследовании выяснилось, что хромосома 18 является наименее прикрепленной хромосомой из проанализированных (рис. 3); (2) Генные локусы со значительными различиями между двумя генными локусами и (рис. 4) (3) теломеры, которые менее сильно прикреплены к покоящимся клеткам по сравнению с пролиферирующими и стареющими клетками (рис. 5). Мы можем различать пролиферирующие и непролиферирующие клетки по присутствию маркера пролиферации антигена Ki67, который является нерастворимым белком, поэтому остается с остаточными ядрами, или используя включение нуклеотидов для выделения клеток, которые прошли через S-фазу в течение определенного периода времени (рис. 2). Этот метод также позволил нам проанализировать поведение генома в клетках, которые скомпрометированы в своих нуклеоскелетах, то есть клетках ламинопатии, и здесь и в Bikkul et al., 2018 мы показываем, что геном может быть менее плотно прикреплен по сравнению с контрольными клетками и может быть восстановлен при лечении конкретными препаратами, которые улучшают эффект мутации ламина А в классических клетках HGPS15. Тем не менее, мы показываем здесь новые данные для атипичных клеток HGPS AGO8466, лишенных мутации ламина А, но содержащих необычную форму белка комплекса LINC SUN1 19, в котором хромосома13 менее плотно прикреплена (рис. 6).
HALO-FISH является уникальным методом, позволяющим изучать геномные взаимодействия с нуклеоскелетом в сочетании с непрямой иммунофлюоресценцией для разрешения белков, не удаленных из процедуры экстракции. Было продемонстрировано, что нуклеоскелет модифицируется при различных заболеваниях, таких как некоторые типы рака19, и важность некоторых белков, связанных с нуклеоскелетом, в качестве диагностических биомаркеров24,25. Таким образом, этот метод играет важную роль в изучении влияния нуклеоскелета на организацию/дезорганизацию хроматина при заболевании 15,24,25,27 и не ограничивается клетками человека, с зондами хромосомного рисования от других животных может быть использован тот же протокол ДНК-гало 28.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить профессора Майкла Биттнера за любезный подарок в виде зондов для рисования хромосом. LG была поддержана финансируемым ЕС проектом EURO-Laminopathies и Исследовательским фондом Брунеля Прогерии.
10X PBS | Thermo Fisher Scientific | 10388739 | Used to create DNA halos |
5-bromo-2′-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | B5002-100MG | Labelled nucleotide |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | Labelled nucleotide |
Agar Technical | Thermo Fisher Scientific | 15562141 | DNA isolation of BAC clones |
Agarose | Sigma-Aldrich | A939-50G | Check product size of DOP-PCR and nick translation |
Atypical type 2 HGPS fibroblasts (AG08466) | Coriell Institute | AG08466 | Cell line |
Bacto tryptone | Thermo Fisher Scientific | 16269751 | DNA isolation of BAC clones |
Biotin-16-dUTP | Roche Diagnostics | 11093711103 | Labelled nucleotides |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378-25G | DNA isolation of BAC clones |
Classical Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) fibroblasts (AG06297) | Coriell Institute | AG0297 | Cell line |
Coplin jar | Thermo Fisher Scientific | 12608596 | Holds 5 slides or 8 slides back to back |
Cot-1 DNA | Thermo Fisher Scientific | 15279011 | Block nonspecific hybridization in HALO FISH |
DEPC-treated water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | DNA isolation of BAC clones |
Dextran sulphate | Sigma-Aldrich | S4030 | Hybridisation mixture |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Component of extraction buffer |
Digoxigenin-11-dUTP | Sigma-Aldrich | 11093088910 | Labelled nucleotides |
Donkey anti-mouse Cy3 | Jackson Laboratory | 715-165-150 | Secondary antibody |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | Component of extraction buffer |
Ethanol | Component of extraction buffer | ||
Ethanol | Sigma-Aldrich | 443611 | Probe precipitation and HALO FISH |
Fetal bovine system | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Cell culture serum |
Formamide | Thermo Fisher Scientific | 10523525 | 2D FISH of DNA halos |
Glass wool | Sigma-Aldrich | 18421 | Spin column |
Herring sperm | Sigma-Aldrich | D7290 | Probe precipitation |
HXP™ Lamp (metal halide microscope lamp) | OSRAM | HXP-R120W45C VIS | Image capture of DNA halos |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher Scientific | 10313680 | Cleaning microscope slides |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516-25ML | DNA isolation of BAC clones |
KAPA HiFi PCR Kit | KAPA Biosystems | KK2103 | PCR Kit |
Leica DM4000 fluorescent microscope with DFC365 FX camera and LAS AF (Version: 4.5.0) image acquisition software. | Leica Microsystems | Image capture of DNA halos | |
Luria-Bertani agar | Thermo Fisher Scientific | 13274843 | DNA isolation of BAC clones |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | Component of CSK buffer |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | 10284580 | Cleaning and sterilizing microscope slides |
Mouse anti-BrdU antibody | BD Pharmingen | B2531-100UL | BrdU visualisation |
Newborn calf serum | Thermo Fisher Scientific | 16010159 | Cell culture serum and blocking reagent |
Nick translation kit | Invitrogen | ||
PCR grade water | Sigma-Aldrich | 693520-1L | PCR and DNA isolation of BAC clones |
PCR Primers | Sigma-Aldrich | ||
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | Component of CSK and extraction buffers |
Potassium acetate | Sigma-Aldrich | P1190-100G | DNA isolation of BAC clones |
QuadriPERM® 4 X 12 | SARSTEDT | 94.6077.307 | Square cell culture dish, polysterene with four compartments. This has hydrophobic surface, is sterile, non-pyrogenic/endotoxin-fee and non-cytotoxic. |
Rabbit Anti-Ki67 antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1007-25UL | Proliferation marker |
Rnase A | Sigma-Aldrich | R6513 | DNA isolation of BAC clones |
Rubber cement | Halford's | 101836 | 2D FISH of DNA halos |
Sephadex G-50 | Sigma-Aldrich | S6022-25G | Spin column |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Probe precipitation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Component of CSK, extraction and SSC buffers |
Sodium citrate | Sigma-Aldrich | C8532 | Component of SSC buffer |
Sodium dodecyl sulphate | L3771-100G | DNA isolation of BAC clones | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | DNA isolation of BAC clones |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | Component of extraction buffer |
Spermine | Sigma-Aldrich | S4264 | Component of extraction buffer |
Streptavidin-Cy3 | Amersham Life Sciences Ltd, Scientific Laboratory Supplies | pa43001 | Probe antibody |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Component of CSK buffer |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | CSK buffer+A66:D68 |
SuperFrost™ microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 12372098 | Microscope slides: 1 mm thickness, 76 mm length, 26 mm width. Uncoated. |
Swine anti-rabbit TRITC | Dako | ||
TELO-PNA FISH KIT | Agilent Dako | K532511-8 | Delineation of telomeres |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253-100G | Column buffer |
Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | Component of CSK buffer |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 10158962 | DNA isolation of BAC clones |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416- 100ML | Detergent |
Vectashield mountant containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | 2D FISH of DNA halos |
Whole human chromosome probes | Calbiochem | 2D FISH of DNA halos | |
Yeast extract | Thermo Fisher Scientific | 10108202 | DNA isolation of BAC clones |