ज़ेब्राफिश भ्रूण दिलों में प्रधानमंत्री२.५-प्रेरितडीएनए क्षति का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करना
Summary
यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश भ्रूण के विच्छेदित दिलों में पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करता है ।
Abstract
परिवेश ठीक कण पदार्थ (पीएम२.५)जोखिम हृदय विकास विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, लेकिन अंतर्निहित आणविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं । 8-हाइड्रोक्सी-2’डिऑक्सीजेनेज (8-ओएचडीजी) ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति का एक मार्कर है और γH2AX डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक के लिए एक संवेदनशील मार्कर है। इस अध्ययन में, हम प्रधानमंत्री२.५-प्रेरित8-OHdG का पता लगाने और एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग कर जेब्राफिश भ्रूण के दिल में परिवर्तन γH2AX उद्देश्य । जेब्राफिश भ्रूण 2 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) में एंटीऑक्सीडेंट एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी, 0.25 माइक्रोन) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पीएम2.5 से एक्सट्रैक्टेबल ऑर्गेनिक मैटर्स (ईओएम) के साथ इलाज किया गया। डीएमएसओ को वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ७२ एचपीएफ में, दिल एक सिरिंज सुई का उपयोग कर भ्रूण से विच्छेदित किया गया और तय और permeabilized । अवरुद्ध होने के बाद 8-ओएचडीजी और γH2AX के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों की जांच की गई । इसके बाद नमूनों को धोया गया और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड किया गया । इसके परिणामस्वरूप छवियों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के तहत देखा गया और इमेजजे का उपयोग करके मात्राकृत किया गया। परिणाम बताते हैं कि पीएम25 से ईओएम ने जेब्राफिश भ्रूण के दिल में 8-ओएचडीजी और γH2AX संकेतों को काफी बढ़ाया। हालांकि, एनएसी, एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) मेहतर के रूप में कार्य, आंशिक रूप से EOM प्रेरित डीएनए क्षति प्रतिक्रिया व्यक्त की । यहां, हम पीएम२.५-प्रेरितहृदय दोषों में डीएनए क्षति की भूमिका की जांच के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे जेब्राफिश भ्रूण के दिलों में पर्यावरणीय रासायनिक प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
वायु प्रदूषण अब दुनिया के सामने एक गंभीर पर्यावरणीय समस्या है । परिवेश ठीक कण पदार्थ (पीएम2.5),जो वायु गुणवत्ता के सबसे महत्वपूर्ण संकेतकों में से एक है, बड़ी संख्या में हानिकारक पदार्थ ले जा सकता है और रक्त संचार प्रणाली में प्रवेश कर सकता है, जिससे मानव स्वास्थ्य को गंभीर नुकसान पहुंच सकता है1। महामारी विज्ञान के अध्ययनों से पता चला है कि पीएम2.5 के संपर्क में आने से जन्मजात हृदय दोष (सीएचडी) 2,3का खतरा बढ़सकताहै . पशु प्रयोगों से मिले साक्ष्यों से यह भी पता चला है कि पीएम25 जेब्राफिश भ्रूण और चूहों की संतानों में असामान्य हृदय विकास का कारण बन सकता है लेकिन पीएम25 की हृदय विकासात्मक विषाक्तता का आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात है4,5,6.
डीएनए क्षति सेल चक्र की गिरफ्तारी का कारण बन सकती है और एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकती है, जो बड़े पैमाने पर जनक कोशिकाओं की क्षमता को नष्ट कर सकती है और परिणामस्वरूप, हृदय विकास7को ख़राब कर सकतीहै)। यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि पीएम2.5सहित पर्यावरण प्रदूषकों में ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस मैकेनिज्म8,9के माध्यम से डीएनए पर हमला करने की क्षमता है। मानव और जेब्राफिश हृदय दोनों का विकास ऑक्सीडेटिव तनाव 10 ,11,12के प्रति संवेदनशील है . 8- ओएचडीजी एक ऑक्सीडेटिव डीएनए डैमेज मार्कर है, और γH2AX सिग्नल डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक का मार्कर है। एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (एनएसी), इंट्रासेलुलर सिस्टीन और ग्लूटाथिएक का सिंथेटिक अग्रदूत, व्यापक रूप से एंटी-ऑक्सीडेटिव यौगिक के रूप में उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, हम एनएसी का उपयोग पीएम25में ऑक्सीडेटिव तनाव की भूमिका की जांच करने के लिए करते हैं – प्रेरित डीएनए क्षति13।
एक मॉडल कशेरुकी के रूप में जेब्राफिश का व्यापक रूप से हृदय विकास और मानव हृदय रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि कशेरुकी विकास के तंत्र14,15कशेरुकी के बीच अत्यधिक संरक्षित होते हैं । एक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश का उपयोग करने के फायदे में उनके छोटे आकार, मजबूत प्रजनन क्षमता और कम भोजन लागत शामिल हैं। इन अध्ययनों के लिए विशेष रुचि के, जेब्राफिश भ्रूण प्रारंभिक विकास के दौरान संचार प्रणाली पर निर्भर नहीं करते हैं और गंभीर हृदय विकृति14जीवित रह सकते हैं। इसके अलावा, उनकी पारदर्शिता पूरे शरीर को सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। इस प्रकार, जेब्राफिश भ्रूण विभिन्न पर्यावरणीय रसायनों के संपर्क में आने के परिणामस्वरूप हृदय विकासात्मक विषाक्तता के प्रेरण में शामिल आणविक तंत्र का आकलन करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदानकरतेहैं5,16,17. हमने पहले बताया है कि पीएम२.५-प्रेरितऑक्सीडेटिव स्ट्रेस डीएनए डैमेज और एपोप्टोसिस की ओर ले जाता है, जिसके परिणामस्वरूप जेब्राफिश18में दिल की विकृतियां होती हैं । इस अध्ययन में, हम जेब्राफिश भ्रूण के दिल में पीएम२.५-प्रेरितडीएनए क्षति की जांच के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि ज़ेब्राफ़िश पर्यावरणीय रसायनों की हृदय विकासात्मक विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट कशेरुकी मॉडल है, भ्रूण हृदय के छोटे आकार के कारण, पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन प…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचर साइंसेज फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर: 81870239, 81741005, 81972999) और जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों की प्राथमिकता अकादमिक कार्यक्रम विकास द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
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