Brug af immunofluorescence til at opdage PM2,5-induceret DNA-skade i Zebrafish Embryo Hearts
Summary
Denne protokol bruger en immunofluorescence assay til at opdage PM2,5-induceretDNA-skader i dissekeret hjerter zebrafisk embryoner.
Abstract
Omgivende fine partikler (PM2.5)eksponering kan føre til hjerteudviklingstoksicitet, men de underliggende molekylære mekanismer er stadig uklare. 8-hydroxy-2’deoxygenase (8-OHdG) er en markør for oxidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA dobbelt streng pauser. I denne undersøgelse, vi havde til formål at opdage PM2,5-induceret 8-OHdG og γH2AX ændringer i hjertet af zebrafisk embryoner ved hjælp af en immunofluorescence assay. Zebrafiskembryoner blev behandlet med ekstraherbare organiske forhold (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær af antioxidant N-acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timer efter befrugtning (hpf). DMSO blev brugt som en køretøjskontrol. Ved 72 hk blev hjerter dissekeret fra embryoner ved hjælp af en sprøjtenål og fastgjort og permeabiliseret. Efter at være blevet blokeret blev prøverne undersøgt med primære antistoffer mod 8-OHdG og γH2AX. Prøverne blev derefter vasket og inkuberet med sekundære antistoffer. De resulterende billeder blev observeret under fluorescensmikroskopi og kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Resultaterne viser, at EOM fra PM2,5 signifikant forbedrede 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet af zebrafiskembryoner. Nac, der fungerede som en reaktiv iltart (ROS) ådselæder, modvirkede imidlertid delvist den EOM-inducerede DNA-skade. Her præsenterer vi en immunfluorescence protokol til undersøgelse af dna-skadernes rolle i PM2,5-inducerede hjertefejl, der kan anvendes til påvisning af miljømæssige kemisk inducerede proteinudtryksændringer i zebrafiskembryoners hjerter.
Introduction
Luftforurening er nu et alvorligt miljøproblem, som verden står over for. Omgivende fine partikler (PM2.5), som er en af de vigtigste indikatorer for luftkvaliteten, kan bære et stort antal skadelige stoffer og komme ind i blodcirkulationssystemet, hvilket forårsager alvorlig skade på menneskers sundhed1. Epidemiologiske undersøgelser har vist , at PM2,5-eksponering kan føre til en øget risiko for medfødte hjertefejl (CHD’er)2,3. Beviser fra dyreforsøg viste også, at PM2,5 kan forårsage unormal hjerteudvikling i zebrafisk embryoner og afkom afmus,men de molekylære mekanismer i hjerteudviklingsmæssige toksicitet PM2,5 er stadig stort set ukendt4,5,6.
DNA-skader kan forårsage cellecyklus anholdelse og fremkalde apoptose, som i vid udstrækning kan ødelægge potentialet i stamcelleceller og dermed forringe hjerteudviklingen7). Det er veldokumenteret, at miljøforurenende stoffer, herunder PM2,5, har potentiale til at angribe DNA gennem oxidative stressmekanismer8,9. Både human og zebrafisk hjerte udvikling er følsomme over for oxidativ stress10,11,12. 8-OHdG er en oxidativ DNA-skadesmarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrud. N-acetyl-L-Cystein (NAC), en syntetisk forløber for intracellulær cystein og glutathion, er meget udbredt som en anti-oxidativ forbindelse. I denne undersøgelse bruger vi NAC til at undersøge den rolle, oxidativ stress i PM2.5– induceret DNA-skade13.
Zebrafisk som model hvirveldyr har været meget udbredt til at studere hjerteudvikling og menneskelige hjerte-kar-sygdomme, fordi mekanismerne i hjerteudvikling er meget bevaret blandt hvirveldyr14,15. Fordelene ved at bruge zebrafisk som model omfatter deres lille størrelse, stærke reproduktive evne og lave fodringsomkostninger. Af særlig interesse for disse undersøgelser er zebrafiskembryoner ikke afhængige af kredsløbssystemet under tidlig udvikling og kan overleve alvorlig hjertemisdannelse14. Desuden gør deres gennemsigtighed det muligt for hele kroppen at blive observeret direkte under et mikroskop. Zebrafiskembryoner giver således en enestående mulighed for at vurdere de molekylære mekanismer, der er involveret i induktion af hjerteudviklingsmæssig toksicitet som følge af eksponering for forskellige miljøkemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapporteret, at PM2,5-induceret oxidativ stress fører til DNA-skader og apoptose, hvilket resulterer i hjertemisdannelser hos zebrafisk18. I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til undersøgelse af PM2,5-induceret DNA-skade i hjertet af zebrafisk embryoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom zebrafisk er en fremragende hvirveldyrmodel til undersøgelse af hjerteudviklingsmæssig toksicitet af miljøkemikalier på grund af embryohjertets lille størrelse, er det svært at opnå nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor præsenterer vi en følsom immunfluorescencemetode til kvantificering af proteinudtryksniveauerne af DNA-skader biomarkører i hjerterne på zebrafiskembryoner, der udsættes for PM2,5.
Under dissektion er det vigtigt at holde hjertets integritet …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Nature Sciences Foundation of China (Grant nummer: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
Riferimenti
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
