Bruke immunfluorescens for å oppdage PM2,5-indusertDNA-skade i sebrafisk embryohjerter
Summary
Denne protokollen bruker en immunfluorescensanalyse for å oppdage PM2,5-indusertDNA-skade i dissekerte hjerter av sebrafiskembryoer.
Abstract
Omgivende fint svevestøv (PM2.5) eksponering kan føre til hjerteutviklingstoksisitet, men de underliggende molekylære mekanismene er fortsatt uklare. 8-hydroksy-2’deoksygenase (8-OHdG) er en markør for oksidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. I denne studien hadde vi som mål å oppdage PM2,5-induserte8-OHdG- og γH2AX-endringer i hjertet av sebrafiskembryoer ved hjelp av en immunfluorescensanalyse. Sebrafiskembryoer ble behandlet med ekstraherbare organiske stoffer (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær av antioksidant N-acetyl-L-cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timers etterbefruktning (hpf). DMSO ble brukt som kjøretøykontroll. Ved 72 hkf ble hjerter dissekert fra embryoer ved hjelp av en sprøytenål og festet og permeabilisert. Etter å ha blitt blokkert, ble prøver undersøkt med primære antistoffer mot 8-OHdG og γH2AX. Prøver ble deretter vasket og inkubert med sekundære antistoffer. De resulterende bildene ble observert under fluorescensmikroskopi og kvantifisert ved hjelp av ImageJ. Resultatene viser at EOM fra PM2,5 signifikant forbedret 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet av sebrafiskembryoer. Nac, som fungerer som en reaktiv oksygenart (ROS) scavenger, motvirket imidlertid delvis den EOM-induserte DNA-skaden. Her presenterer vi en immunfluorescence protokoll for å undersøke rollen som DNA-skade i PM2.5-induserte hjertefeil som kan brukes på påvisning av miljøkjemisk-indusert protein uttrykk endringer i hjertene til sebrafisk embryoer.
Introduction
Luftforurensning er nå et alvorlig miljøproblem verden står overfor. Omgivende fint svevestøv (PM2.5), som er en av de viktigste indikatorene for luftkvalitet, kan bære et stort antall skadelige stoffer og komme inn i blodsirkulasjonssystemet, noe som forårsaker alvorlig skade på menneskers helse1. Epidemiologi studier har vist at PM2.5 eksponering kan føre til økt risiko for medfødte hjertefeil (CHDs)2,3. Bevis fra dyreforsøk viste også at PM2.5 kan forårsake unormal hjerteutvikling i sebrafiskembryoer og avkom av mus, men de molekylære mekanismene for hjerteutviklingstoksisiteten til PM2.5 er fortsatt stort sett ukjent4,5,6.
DNA-skade kan forårsake cellesyklusstans og indusere apoptose, noe som i stor grad kan ødelegge potensialet til stamceller og dermed svekkehjerteutviklingen 7). Det er godt dokumentert at miljøgifter, inkludert PM2.5, har potensial til å angripe DNA gjennom oksidative stressmekanismer8,9. Både menneskelig og sebrafisk hjerteutvikling er følsom for oksidativt stress10,11,12. 8-OHdG er en oksidativ DNA-skademarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrudd. N-acetyl-L-cystein (NAC), en syntetisk forløper for intracellulær cystein og glutathione, er mye brukt som en antioksidantforbindelse. I denne studien bruker vi NAC til å undersøke rollen som oksidativt stress i PM2.5– indusert DNA-skade13.
Sebrafisk som modell vertebrat har blitt mye brukt til å studere hjerteutvikling og menneskelige kardiovaskulære sykdommer fordi mekanismer for hjerteutvikling er høyt bevart blant vertebrater14,15. Fordelene ved å bruke sebrafisk som modell inkluderer deres lille størrelse, sterke reproduktive evne og lave fôringskostnader. Av spesiell interesse for disse studiene er sebrafisk embryoer ikke avhengige av sirkulasjonssystemet under tidlig utvikling og kan overleve alvorlighjertefeildannelse 14. Videre tillater deres gjennomsiktighet hele kroppen å bli direkte observert under et mikroskop. Dermed gir sebrafiskembryoer en enestående mulighet til å vurdere molekylære mekanismer som er involvert i induksjon av hjerteutviklingstoksisitet som følge av eksponering for ulike miljøkjemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapportert at PM2,5-indusertoksidativt stress fører til DNA-skade og apoptose, noe som resulterer i hjerte misdannelser i sebrafisk18. I denne studien gir vi en detaljert protokoll for undersøkelse av PM2,5-indusertDNA-skade i hjertet av sebrafiskembryoer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om sebrafisk er en utmerket virveldyrmodell for å studere hjerteutviklingstoksisiteten til miljøkjemikalier, på grunn av den lille størrelsen på embryohjertet, er det vanskelig å skaffe nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor presenterer vi en sensitiv immunfluorescensmetode for å kvantifisere proteinuttrykksnivåene av DNA-skadebiomarkører i hjertene til sebrafiskembryoer utsatt for PM2.5.
Under disseksjonen er det viktig å holde hjertets integritet intakt. Vår e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Nature Sciences Foundation of China (Grant number: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
Riferimenti
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
