면역 형광을 사용하여 제브라피시 배아 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
Summary
이 프로토콜은 면역 형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 해부 된 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
Abstract
주변 의 미세 미립자 물질 (PM2.5)노출은 심장 발달 독성으로 이어질 수 있지만 기본 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 8-하이드록시-2’탈산소제(8-OHdG)는 산화 DNA 손상의 마커이며 γH2AX는 DNA 이중 가닥 파손에 대한 민감한 마커이다. 이 연구에서는 면역형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM2.5-유도8-OHdG 및 γH2AX 의 변화를 검출하는 것을 목표로 했습니다. Zebrafish 배아는 2h 후 수정(hpf)에서 항산화 N-아세틸-L-시스테인(NAC, 0.25 μM)의 존재 또는 부재 시 PM2.5에서 추출 가능한 유기 물질(EOM)으로 치료되었다. DMSO는 차량 제어로 사용되었습니다. 72 hpf에서, 심혼은 주사기 바늘을 사용하여 배아에서 해부되고 고정되고 permeabilized되었습니다. 차단 된 후, 샘플은 8-OHdG 및 γH2AX에 대한 1 차 적인 항체로 조사되었다. 시료는 그 때 세척하고 이차 항체로 배양하였다. 결과 심상은 형광 현미경 검사의 밑에 관찰되고 ImageJ를 사용하여 정량화되었습니다. 결과는 PM2.5에서 EOM이 제브라피시 배아의 심장에 있는 8-OHdG 및 γH2AX 신호를 현저하게 향상했다는 것을 보여줍니다. 그러나, NAC는 반응성 산소 종(ROS) 폐포제로 작용하여 EOM 유도 DNA 손상을 부분적으로 중화하였다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아의 심장에서 환경 화학 유발 단백질 발현 변화의 검출에 적용될 수 있는 PM2.5-유도된심장 결함에서 DNA 손상의 역할을 조사하기 위한 면역형성 프로토콜을 제시한다.
Introduction
대기 오염은 이제 세계가 직면한 심각한 환경 문제입니다. 대기질의 가장 중요한 지표 중 하나인 주변 미세미립자 물질(PM2.5)은많은 유해 물질을 운반하고 혈액 순환 시스템에 들어갈 수 있어 인체 건강에 심각한 해를 끼칠 수있다 1. 역학 연구는 PM2.5 노출이 선천성 심장 결함 (CHDs)2,3의증가한 리스크로 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여주었습니다. 동물 실험에서 증거는 또한 PM2.5가 제브라피시 배아와 마우스의 자손에서 비정상적인 심장 발달을 일으킬 수 있지만 PM2.5의 심장 발달 독성의 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려지지 않은4,5,6을보여주었다.
DNA 손상은 세포 주기 체포를 유발하고 세포 세포의 잠재력을 광범위하게 파괴할 수 있는 세포 세포 멸망을 유발할 수 있으며, 결과적으로 심장발달7을손상시킬 수 있다. PM2.5를포함한 환경 오염 물질이 산화 스트레스 메커니즘8,9를통해 DNA를 공격할 가능성이 있다는 것이 잘 문서화되어 있다. 인간과 제브라피쉬 심장 발달은 산화 스트레스10,11,12에민감하다. 8-OHdG는 산화 DNA 손상 마커이며, γH2AX 신호는 DNA 이중 가닥 파손의 마커이다. N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 세포 내 시스테인과 글루타티온의 합성 선구자, 널리 산화 화합물로 사용 된다. 이 연구에서는 NAC를 사용하여 PM2.5에서산화 스트레스의 역할을 조사합니다 – 유도된 DNA손상(13).
모델 척추동물로서 제브라피쉬는 심장 발달 및 인간 심혈관 질환을 연구하는 데 널리 사용되고 있으며, 이는 심장 발달의 메커니즘이 척추동물14,15사이에서 높게 보존되기 때문이다. 모델로 제브라피쉬를 사용하는 장점은 작은 크기, 강한 생식 능력 및 낮은 수유 비용을 포함합니다. 이러한 연구에 특히 관심이 있는 제브라피시 배아는 초기 발달 중 순환 시스템에 의존하지 않으며 심한 심장기형(14)에서살아남을 수 있다. 더욱이, 그들의 투명성은 현미경의 밑에 바디 전체가 직접 관찰될 수 있습니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 다양한 환경화학물질5,16,17에노출됨에 따라 심장 발달 독성유도에 관여하는 분자기전기를 평가할 수 있는 뛰어난 기회를 제공한다. 우리는 이전에 PM2.5유도 된 산화 스트레스가 DNA 손상및 석멸증으로 이어지며, 제브라피시 18에서 심장 기형이 발생한다고보고했습니다. 이 연구에서는, 우리는 제브라피시 배아의 심혼에 있는 PM2.5유도한 DNA 손상을 조사하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라피쉬는 환경 화학물질의 심장 발달 독성을 연구하기 위한 우수한 척추동물 모델이지만, 배아 심장의 크기가 작기 때문에 서양 얼룩 분석을 위한 충분한 단백질을 얻기가 어렵다. 따라서, PM2.5에노출된 제브라피쉬 배아의 심장에 DNA 손상 바이오마커의 단백질 발현 수준을 정량화하기 위한 민감한 면역형광방법을 제시한다.
해부 동안, 마음의 무결성을 온전하게 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 : 81870239, 81741005, 81972999)과 장쑤 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발에 의해 지원되었다.
Materials
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
Riferimenti
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d’Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
