Förfinad KLARHET-baserad vävnadsrensning för tredimensionell fibroblastorganisation i friska och skadade mushjärtan
Summary
En raffinerad metod för vävnad clearing utvecklades och tillämpas på den vuxna mus hjärtat. Denna metod utformades för att rensa tät, autofluorescerande hjärtvävnad, samtidigt som märkt fibroblast fluorescens tillskrivs en genetisk reporter strategi.
Abstract
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen och kännetecknas ofta av förhöjd hjärtfibros som kan leda till ökad ventrikulär styvhet med förändrad hjärtfunktion. Denna ökning av hjärt ventrikulär fibros beror på aktivering av bosatta fibroblaster, även om hur dessa celler fungerar inom det 3-dimensionella (3D) hjärtat, vid baslinjen eller efter aktivering, är inte väl förstådd. För att undersöka hur fibroblaster bidrar till hjärtsjukdomar och deras dynamik i 3D-hjärtat utvecklades en förfinad CLARITY-baserad vävnadsrensnings- och bildbehandlingsmetod som visar fluorescerande märkta hjärtfibroblaster i hela mushjärtat. Vävnad bosatta fibroblaster var genetiskt märkta med Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter möss korsade med hjärt fibroblast uttrycker Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denna teknik användes för att observera fibroblast lokalisering dynamik i hela vuxna vänstra ventrikel i friska möss och i fibrotic mus modeller av hjärtsjukdomar. Intressant nog, i en skademodell, observerades unika mönster av hjärt fibroblaster i det skadade mushjärtat som följde band av inslagna fibrer i kontraktil riktning. I ischemiska skademodeller inträffade fibroblast död, följt av återpopulation från den infarkt gränszonen. Sammantaget möjliggör denna raffinerade hjärtvävnad klargörande teknik och digitaliserade bildframställning system 3D visualisering av hjärt fibroblaster i hjärtat utan begränsningar av antikroppar penetration misslyckande eller tidigare problem kring förlorade fluorescens på grund av vävnad bearbetning.
Introduction
Även om kardiomyocyter utgör den största volymfraktionen i hjärtat, är hjärtfibroblaster mer rikliga och är kritiskt involverade i regleringen av utgångsvärdet strukturella och reparativa funktioner i detta organ. Hjärtfibroblaster är mycket mobila, mekaniskt lyhörda och fenotypiskt olika beroende på omfattningen av deras aktivering. Hjärtfibroblaster är nödvändiga för att upprätthålla normala nivåer av extracellulär matris (ECM), och för lite eller för mycket ECM-produktion av dessa celler kan leda till sjukdom1,2,3. Med tanke på deras betydelse vid sjukdom har hjärtfibroblaster blivit ett allt viktigare ämne för undersökning för att identifiera nya behandlingsstrategier, särskilt för att försöka begränsa överdriven fibros4,5,6,7. Vid skada aktiverar och skiljer fibroblaster till en mer syntetisk celltyp som kallas myofibroblast, som kan vara proliferativ och utsöndra riklig ECM, samt ha kontraktil aktivitet som hjälper till att bygga om ventriklarna.
Medan hjärtfibroblaster har utvärderats utförligt för sina egenskaper i 2D-kulturer6,8,9,10, är mycket mindre förstås av deras egenskaper och dynamik i 3D-levande hjärtat, antingen vid baslinjen eller med sjukdomsstimulering. Här har en förfinad metod beskrivits för att rensa det vuxna mushjärtat samtidigt som fluorescensen av fibroblaster märkt med ett Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reportersystem. Inom hjärtat är Tcf21 en relativt specifik markör för quiescent fibroblaster4. Efter tamoxifen ges för att aktivera det inducerbara MerCreMer proteinet, i huvudsak alla quiescent fibroblaster kommer permanent att uttrycka förbättrad grön fluorescerande protein (eGFP) från Rosa26 locus, vilket möjliggör deras spårning in vivo.
Många väletablerade vävnadsrensningsprotokoll finns, av vilka några har tillämpats på hjärtat11,12,13,14,15,16,17. Många av de reagenser som används i olika vävnadsrensningsprotokoll har dock visat sig släcka endogena fluorescenssignaler18. Dessutom är det vuxna hjärtat svårt att rensa på grund av rikliga heme gruppinnehållande proteiner som genererar autofluorescens19. Därför var målet med detta protokoll att bevara fibroblast markör fluorescens med samtidig hämning av heme autofluorescens i det skadade vuxna hjärtat för optimal 3D-visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.
Tidigare studier som försökte undersöka hjärtfibroblast in vivo använde perfused antikroppar för att märka dessa celler, även om sådana studier begränsades av antikroppar penetration och hjärt vaskulär struktur14,16,17,20. Även om Salamon et al. har visat vävnad clearing med underhåll av aktuella neuronal fluorescens i neonatal hjärtat, och Nehrhoff et al. har visat underhåll av fluorescens märkning myeloiska celler, underhåll av endogena fluorescens genom hela Ventrikulärt väggen har ännu inte visats, inklusive visualisering av vuxna hjärt fibroblaster vid baslinjen eller efter skada13,20. Detta protokoll för vävnadsrensning förfinar en blandning av tidigare protokoll baserade på CLARITY-metoden (klar lipidväxlade akrylamidhybridiserade styva Imaging/immunostaining/in situ-hybridisering-kompatibla vävnad hydrogel) och PEGASOS (polyetylenglykol (PEG)-associerade lösningsmedel system). Detta förfinade protokoll tillät en mer robust undersökning av hjärtfibroblaster i mushjärtat vid baslinjen och hur de svarar på olika typer av skador. Protokollet är enkelt och reproducerbart och kommer att bidra till att karakterisera beteendet hos hjärtfibroblaster in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel presenterar en raffinerad metod för vävnad clearing som möjliggör visualisering av hjärt fibroblaster in vivo, både vid baslinjen och efter skada, att karakterisera och bättre förstå fibroblaster i mus hjärtat. Detta förbättrade protokoll behandlar begränsningar i befintliga vävnadsrensningsprotokoll som har försökt identifiera specifika celltyper i vuxen- eller neonatalhjärtat12,13,14,<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill uppmärksamma CCHMC Confocal Imaging Core för deras hjälp och vägledning i utvecklingen av denna modell, liksom Matt Batie från Clinical Engineering för design av alla 3D-tryckta delar. Demetria Fischesser stöddes av ett utbildningsbidrag från National Institutes of Health, (NHLBI, T32 HL125204) och Jeffery D. Molkentin stöddes av Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
Riferimenti
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
