Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme
Summary
Rafine bir doku temizleme yöntemi geliştirildi ve yetişkin fare kalbine uygulandı. Bu yöntem, genetik bir muhabir stratejisine atfedilen etiketli fibroblast floresan korurken yoğun, otoflüoresan kalp dokusunu temizlemek için tasarlanmıştır.
Abstract
Kardiyovasküler hastalık dünya çapında en yaygın mortalite nedenidir ve genellikle değiştirilmiş kardiyak fonksiyon ile artmış ventrikül sertliğine yol açabilecek yüksek kardiyak fibrozis ile işaretlenir. Kardiyak ventrikül fibrozislerindeki bu artış, yerleşik fibroblastların aktivasyonundan kaynaklanmaktadır, ancak bu hücrelerin 3 boyutlu (3-B) kalp içinde, taban çizgisine veya aktivasyondan sonra nasıl çalıştığı iyi anlaşılamamıştır. Fibroblastların kalp hastalıklarına ve 3 boyutlu kalpteki dinamiklerine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için, tüm fare kalbinde floresan etiketli kardiyak fibroblastları gösteren rafine clarity tabanlı bir doku temizleme ve görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir. Doku yerleşik fibroblastlar genetik olarak Rosa26-loxP-eGFP floresan muhabir fareleri tcf21-MerCreMer knock-in hattını ifade eden kardiyak fibroblast ile geçti kullanılarak etiketlendi. Bu teknik, sağlıklı farelerde ve kalp hastalığının fibrotik fare modellerinde tüm yetişkin sol ventrikül boyunca fibroblast lokalizasyon dinamiklerini gözlemlemek için kullanılmıştır. İlginçtir ki, bir yaralanma modelinde, kasnak yönünde sarılmış lif bantlarını takip eden yaralı fare kalbinde benzersiz kardiyak fibroblast desenleri gözlenmiştir. İskemik yaralanma modellerinde fibroblast ölümü meydana geldi, ardından enfarktüs sınır bölgesinden repopülasyon yapıldı. Toplu olarak, bu rafine kardiyak doku netleştirme tekniği ve dijitalleştirilmiş görüntüleme sistemi, antikor penetrasyon yetmezliği veya doku işleme nedeniyle kaybedilen floresan ile ilgili önceki sorunlar sınırlamaları olmadan kalpteki kardiyak fibroblastların 3 boyutlu görselleştirilmesine izin verir.
Introduction
Kardiyomiyositler kalpteki en büyük hacim fraksiyonunu oluşturmasına rağmen, kardiyak fibroblastlar daha boldur ve bu organın temel yapısal ve onarıcı özelliklerinin düzenlenmesinde kritik olarak yer almaktadır. Kardiyak fibroblastlar, aktivasyonlarının kapsamına bağlı olarak son derece hareketli, mekanik olarak duyarlı ve fenotipik olarak değişir. Kardiyak fibroblastlar normal hücre dışı matris (ECM) seviyelerini korumak için gereklidir ve bu hücreler tarafından çok az veya çok fazla ECM üretimi hastalığa yol açabilir1,2,3. Hastalıktaki önemleri göz önüne alındığında, kardiyak fibroblastlar, özellikle aşırı fibrozis 4 ,5, 6,7’yi sınırlamaya çalışırken, yeni tedavi stratejilerini belirlemeye yönelik giderek daha önemli bir araştırma konusuhalinegelmiştir. Yaralanma üzerine fibroblastlar, ventriküllerin yeniden şekillendirilmesine yardımcı olan kasılma aktivitesinin yanı sıra proliferatif ve bol ECM salgılaabilen miofibroblast olarak bilinen daha sentetik bir hücre tipini aktive eder ve farklılaşır.
Kardiyak fibroblastlar 2-B kültürleri 6 ,8,9,10‘daki özellikleri için kapsamlı bir şekilde değerlendirilirken, 3-B canlı kalpteki özellikleri ve dinamikleri, taban çizgisi veya hastalık stimülasyonu ile çok daha az anlaşılmaktadır. Burada, Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetik muhabir sistemi ile etiketlenmiş fibroblastların floresanını korurken yetişkin fare kalbini temizlemek için rafine bir yöntem tanımlanmıştır. Kalp içinde, Tcf21 sessiz fibroblastların nispeten spesifik bir belirtecidir4. Tamoksifen indüklenen MerCreMer proteinini aktive etmek için verildikten sonra, esasen tüm sessiz fibroblastlar Rosa26 lokusundan gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) kalıcı olarak ifade edecektir, bu da vivo olarak izlenmesini sağlar.
Bazıları kalbe uygulanan çok sayıda köklü doku temizleme protokolü vardır11 , 12,13,14,15,16,17. Bununla birlikte, farklı doku temizleme protokollerinde kullanılan reaktiflerin çoğunun endojen floresan sinyallerini söndürdür olduğu bulunmuştur18. Ek olarak, yetişkin kalbinin otofluoresans üreten bol miktarda heme grubu içeren proteinler nedeniyle temizlenmesi zordur19. Bu nedenle, bu protokolün amacı, in vivo 12 , 13,14,16,17,20’deoptimal3-B görselleştirme için yaralı yetişkin kalbinde heme otofluoresansının eşzamanlı inhibisyonu ile fibroblast belirteç floresanını korumaktı.
Kardiyak fibroblast in vivo’yu incelemeye çalışan önceki çalışmalar, bu hücreleri etiketlemek için perfüzyonlu antikorlar istihdam etti, ancak bu çalışmalar antikor penetrasyonu ve kardiyak vasküler yapı ile sınırlıydı14,16,17,20. Salamon ve arkadaşları yenidoğan kalbinde topikal nöronal floresan bakımı ile doku temizleme göstermiş olsalar da ve Nehrhoff ve diğerleri miyeloid hücreleri işaretleyen floresanların bakımını göstermiş olsalar da, yetişkin kardiyak fibroblastların taban çizgisine görselleştirilmesi veya yaralanmanın ardından13,20. Bu doku temizleme protokolü, CLARITY yöntemine (berrak lipid ile değiş tokuş edilen akrilamid-hibrid sert Görüntüleme/immünostaining/in situ-hibridizasyon uyumlu doku hidrojel) ve PEGASOS (polietilen glikol (PEG) ilişkili çözücü sistemi) temel alınarak önceki protokollerin bir karışımını rafine eder. Bu rafine protokol, fare kalbindeki kardiyak fibroblastların taban çizgisine ve farklı yaralanma türlerine nasıl tepki verdiklerine dair daha sağlam bir incelemeye izin verdi. Protokol basit ve tekrarlanabilir ve in vivo kardiyak fibroblastların davranışını karakterize etmenize yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, fare kalbindeki fibroblastları karakterize etmek ve daha iyi anlamak için hem taban çizgisi hem de yaralanmayı takiben in vivo kardiyak fibroblastların görselleştirilmesine izin veren doku temizleme için rafine bir yöntem sunmaktadır. Bu gelişmiş protokol, yetişkin veya yenidoğan kalbindeki belirli hücre tiplerini tanımlamaya çalışan mevcut doku temizleme protokollerindeki sınırlamaları ele12 , 13,14,<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu modelin geliştirilmesinde yardımları ve rehberlikleri için CCHMC Confocal Imaging Core’un yanı sıra tüm 3D baskılı parçaların tasarımı için Klinik Mühendislik’ten Matt Batie’yi kabul etmek istiyor. Demetria Fischesser Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (NHLBI, T32 HL125204) ve Jeffery D. Molkentin Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından desteklendi.
Materials
| 4-0 braided silk | Ethicon | K871H | |
| 8-0 prolene | Ethicon | 8730H | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | |
| Angiotensin II | Sigma | A9525-50G | |
| Artificial Tear Ointment | Covetrus | 048272 | |
| DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) | Millipore Sigma | D27802-25G | |
| GLUture topical tissue adhesive | World Precision Instruments | 503763 | |
| Heparin | Sigma | H0777 | |
| Imaris Start Analysis Software | Oxford Instruments | N/A | |
| Micro-osmotic pumps | Alzet | Model 1002 | |
| Nikon Elements Analysis Software | Nikon | N/A | |
| Nikon A1R HD upright microscope | Nikon | N/A | |
| Normal autoclaved chow | Labdiet | 5010 | |
| Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide |
CosmoBio | AXS-1002424 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phenylephrine Hydrochloride | Sigma | P6126-10G | |
| Photoinitiator | Wako Chemicals | VA-044 | |
| Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] | Jackson Laboratories | Jax Stock No:012429 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium Chloride solution | Hospira, Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Tamoxifen food | Envigo | TD.130860 | |
| Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent | Millipore Sigma | 122262-1L | |
| X-Clarity electrophoretic clearing chamber | Logos Biosystems | C30001 | |
| X-Clarity electrophoretic clearing solution | Logos Biosystems | C13001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket | Logos Biosystems | C12001 | |
| X-Clarity electrophoresis tissue basket holder | Logos Biosystems | C12002 |
Riferimenti
- Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
- Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
- Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
- Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
- Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
- Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
- Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434 (2017).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573 (2019).
- Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406 (2017).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
- Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
- Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
- Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072 (2017).
- Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
- Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
- Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology – Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
- Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
- Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
- Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
- Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
- Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
