Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare
Summary
Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.
Abstract
I peptidi penetranti nelle cellule (CPP) sono definiti come vettori in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule. Una delle principali caratteristiche comuni richieste per questa attività deriva dalle interazioni dei CPP con la membrana plasmatica (lipidi) e più in particolare con componenti della matrice extracellulare della membrana stessa (eparano solfato). Infatti, indipendentemente dalla traslocazione diretta o dall’internalizzazione endocitosi-dipendente, i doppi strati lipidici sono coinvolti nel processo di internalizzazione sia a livello della membrana plasmatica che a livello del traffico intracellulare (vescicole endosomiali). In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive le diverse fasi di una formulazione, purificazione, caratterizzazione e applicazione di vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) nel saggio di perdita di fluorescenza al fine di rilevare possibili destabilizzazioni / interazioni CPP-membrana e affrontare il loro ruolo nel meccanismo di internalizzazione. I LUV con una composizione lipidica che riflette il contenuto della membrana plasmatica vengono generati per incapsulare sia un colorante fluorescente che un quencher. L’aggiunta di peptidi nel mezzo extravesicolare e l’induzione di interazioni peptido-membrana sui UV potrebbero quindi indurre in modo dose-dipendente un significativo aumento della fluorescenza rivelando una perdita. Esempi sono forniti qui con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WNAP) ricchi di recente, che hanno mostrato una consegna rapida ed efficiente di siRNA in varie linee cellulari. Infine, la natura di queste interazioni e l’affinità per i lipidi sono discusse per comprendere e migliorare la traslocazione della membrana e/o la fuga endosomiale.
Introduction
Dopo la loro scoperta negli anni novanta, sono stati sviluppati peptidi penetranti nelle cellule (CPP) per promuovere un efficiente trasporto cellulare di carichi attraverso la membranaplasmatica 1,2. I CPP sono di solito peptidi corti, generalmente da 8 a 30 amminoacidi, con un’ampia varietà di origini. Sono stati inizialmente definiti come portatori “traslocanti diretti”, il che significa che erano in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule indipendentemente da qualsiasi via endocitotica né dal fabbisogno energetico né dal coinvolgimento del recettore. Tuttavia, ulteriori indagini hanno rivelato che queste prime osservazioni provenivano principalmente da sovrastima di fluorescenza dovuta all’artefatto sperimentale e / o ai protocolli di fissazione che utilizzavano metanolo3. Al giorno d’oggi, è ampiamente accettato che l’assorbimento di CPP avviene sia per endocitosi che per traslocazione indipendente dall’energia4,5,6,7 a seconda di diversi parametri come la natura del carico, il collegamento utilizzato tra CPP e carico, la linea cellulare studiata, ecc.
I CPP possono essere utilizzati come agenti di trasfezione secondo due strategie, che coinvolgono un legame chimico (strategia covalente) o interazioni elettrostatiche / idrofobiche (strategia non covalente) tra il CPP e il suo carico8,9,10,11. Sebbene entrambe le strategie abbiano dimostrato la loro efficienza nel trasferimento cellulare di diversi carichi, la comprensione del meccanismo di internalizzazione da parte dei CPP è ancora controversa e l’equilibrio tra vie di endocitosi o penetrazione diretta è ancora difficile da misurare12,13. Sebbene sia disponibile una serie di strumenti e strategie sperimentali per affrontare chiaramente il coinvolgimento dei processi endocitici, la traslocazione diretta sembra, tuttavia, più difficile da caratterizzare poiché implica interazioni più discrete con i componenti della membrana plasmatica. Le membrane biologiche sono solitamente composte da numerosi componenti, dai fosfolipidi alle proteine di membrana, che possono variare a seconda del tipo cellulare e/o dell’ambiente (condizioni di stress, divisione cellulare, ecc.). Questa diversità di composizione, e di conseguenza l’assenza di un modello di membrana cellulare universale, non consente studi in un unico modo. Tuttavia, per aggirare queste limitazioni sono stati sviluppati approcci passo-passo con estratti di membrana o membrana artificiali. Dalle piccole vescicole unilamellari agli approcci monostrato, ogni modello era chiaramente pertinente per rispondere alle domande specifiche14,15. Tra questi, le grandi vescicole unilamellari (LUV) costituiscono un modello appropriato di imitazione della membrana per studiare le interazioni peptide/ membrana come punto chiave nel processo di internalizzazione.
In questo contesto, il seguente protocollo descrive lo studio degli effetti dei peptidi e delle interazioni peptidi/membrana sull’integrità dei LUD attraverso il monitoraggio sia di un colorante fluorescente anionico che del corrispondente quencher policanica incapsulato in liposomi. Questo strumento viene utilizzato per studiare le interazioni CPP/membrana al fine di capire se sono in grado di eseguire una traslocazione diretta della membrana. Sebbene di solito applicato per confrontare diversi peptidi che interagiscono con la membrana, questo saggio di perdita di fluorescenza LUV potrebbe anche essere utilizzato per studiare sia i coniugati CPP-cargo (strategia covalente) che i complessi CPP:cargo (strategia non covalente).
Il presente protocollo sarà quindi prima esemplificato con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WRAP)16recentemente sviluppati. WRAP è in grado di formare nanoparticelle a base di peptidi per fornire rapidamente ed efficacemente piccoli RNA interferenti (siRNA) in diverse linee cellulari16. Le proprietà di perdita di fluorescenza del peptide WRAP da solo o delle nanoparticelle a base di WRAP caricate con siRNA sono state monitorate per caratterizzare il loro meccanismo di internalizzazione cellulare. La Corte ha dimostrato che il loro meccanismo di internalizzazione riguardava principalmente la traslocazione diretta7. In un secondo esempio, il peptide WRAP è stato coniugato covalentemente al peptide interferente proteina/proteina iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e la sua capacità di destabilizzare le membrane è stata confrontata in un saggio di perdita di fluorescenza con iCAL36 accoppiato a Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), un altro CPP.
Infine, verranno discussi i vantaggi e i limiti del metodo sia dal punto di vista tecnologico che rispetto alla rilevanza biologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test di perdita di fluorescenza presentato è un metodo semplice e veloce per affrontare la destabilizzazione della membrana da parte del peptide che penetra nelle cellule. Facile da fare, consente anche un confronto indiretto tra diversi peptidi che interagiscono con la membrana o altre molecole che interagiscono con la membrana. Per quanto riguarda le fasi critiche del protocollo, poiché questo test fornisce valori relativi tra il basale (SOLO LUV) e il massimo rilascio di fluorescenza (condizione di Triton), di so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Emilie Josse per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla fondazione “La Ligue contre le Cancer”, dalla “Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer” e dal “Centre National de la Recherche Scientifique” (CNRS).
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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