세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 조사하기 위한 형광 누설 분석
Summary
형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.
Abstract
세포 관통 펩티드(CpP)는 플라즈마 멤브레인을 교차하고 화물을 세포로 이송할 수 있는 운반체로 정의됩니다. 이 활동에 필요한 주요 일반적인 특징 중 하나는 플라즈마 멤브레인 (지질)과 CPP의 상호 작용및 특히 막 자체의 세포 외 매트릭스 (heparan sulphate)의 구성 요소에서 비롯되었습니다. 실제로, 직접적인 전좌 또는 내분비에 의존하는 내재화와는 별개로, 지질 이중층은 혈장 막의 수준과 세포내 교통(내외 소포)의 수준에서 모두 내화 공정에 관여한다. 이 문서에서는 가능한 CPP 멤브레인 불안정화/상호 작용을 감지하고 내부화 메커니즘에서 자신의 역할을 해결하기 위해 형광 누설 분석에서 큰 단음제 소포(LUV) 제제, 정제, 특성화 및 응용 프로그램의 다른 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 혈장 막 함량을 반영하는 지질 조성물을 가진 루프는 형광염과 담수를 모두 캡슐화하기 위해 생성된다. 루프염증에 대한 펩티드-멤브레인 상호작용의 외과 배지에 펩타이드를 첨가하고 따라서 투여량 의존적 방식으로 유도하여 누설을 드러내는 형광의 현저한 증가를 유도할 수 있다. 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙양용 펩타이드(WRAPP)와 함께 다양한 세포주에서 신속하고 효율적인 siRNA 전달을 보여 준 사례가 여기에 제공된다. 마지막으로, 이러한 상호 작용의 본질과 지질에 대한 친화력은 막 전좌 및/또는 내인성 탈출을 이해하고 개선하기 위해 논의됩니다.
Introduction
90년대에 발견된 후, 세포 관통 펩티드(CpP)는 혈장 막1,2를통해 화물의 효율적인 세포 전달을 촉진하기 위해 개발되었다. CpPs는 일반적으로 짧은 펩티드, 일반적으로 8 ~ 30 아미노산, 기원의 다양 한 데. 그(것)들은 처음에 “직접 배분하는” 운반체로 정의되었습니다, 그(것)들이 플라즈마 막을 교차하고 에너지 요구 사항도 수용체 관여도 없는 어떤 내분 통로와 독립적으로 세포로 화물을 전송할 수 있었다는 것을 의미합니다. 그러나, 추가 조사는 이러한 첫 번째 관찰이 주로 실험 동맥 및 /또는 메탄올3을사용하여 고정 프로토콜에 형광 과대 평가에서 온 것으로 나타났다. 요즘CPP 섭취량은 내분세포증과 에너지 독립적인 전좌4,5,6,7 이에 따라 화물의 특성, CPP와 화물 간의 사용 링크, 연구된 세포주 등과 같은 다른 파라미터에 따라 이루어지는 것으로 널리 받아들여지고 있다.
CPP는 CPP와그 화물8,9,10,11사이의 화학 링크(covalent strategy) 또는 정전기/소수성 상호 작용(비-공유 전략)을 포함하는 두 가지 전략에 따라 경전제로서 사용될 수 있다. 두 전략 모두 여러 화물의 세포 전달에 효율성을 보였지만, CPP에 의한 내산화 메커니즘에 대한 이해는 여전히 논란의 여지가 있으며 내분비 경로 또는 직접 침투 사이의 균형은 여전히12,13을측정하기 어렵다. 일련의 실험 도구와 전략이 내막 프로세스의 개입을 명확하게 해결할 수 있지만, 직접 전좌는 플라즈마 멤브레인 구성 요소와의 보다 이산적인 상호 작용을 의미하기 때문에 특성화하기가 더 어려워 보입니다. 생물학적 막은 일반적으로 세포 유형 및/또는 환경(스트레스 조건, 세포 분열 등)에 따라 달라질 수 있는 인지질에서 막 단백질에 이르기까지 수많은 성분으로 구성됩니다. 이러한 구성의 다양성, 따라서 보편적인 세포막 모델의 부재는 한 가지 방법으로 연구를 가능하게 하지 않는다. 그러나 이러한 한계를 우회하기 위해 단계별 접근법은 인공 막 또는 멤브레인 추출물로 개발되었다. 작은 unilamellar 소포에서 단층 접근법에 이르기까지 모든 모델은 특정 질문에14,15에분명히 답하는 데 관련이 있었습니다. 그 중에서도, 큰 unilamellar 소포 (LUV)는 내재화 프로세스의 핵심 포인트인 펩티드 /멤브레인 상호 작용을 연구하기 위한 적절한 멤브레인 모방 모델을 구성한다.
이러한 맥락에서, 다음 프로토콜은 음이온 형광염과 리포솜에 캡슐화된 해당 다양양이온 담수의 모니터링을 통해 LUV 무결성에 대한 펩타이드 및 펩타이드/멤브레인 상호 작용의 영향에 대한 조사를 설명합니다. 이 도구는 직접 멤브레인 전좌를 수행 할 수 있는지 여부를 이해하기 위해 CPP / 멤브레인 상호 작용을 연구하는 데 사용됩니다. 일반적으로 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드를 비교하기 위해 적용되었지만,이 LUV 형광 누설 분석은 CPP-화물 공자 (공유 전략)와 CPP :화물 단지 (비 공유 전략)를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
따라서 본 프로토콜은 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙요법 펩타이드(WRAP)16과함께 먼저 예시된다. WRAP은 펩티드 계 나노입자를 형성하여 여러세포주(16)에서소형 간섭 RNA(siRNA)를 신속하고 효율적으로 전달할 수 있다. WRAP 펩티드 단독으로 또는 siRNA-로드 WRAP 계 나노입자의 형광 누설 특성을 모니터링하여 세포 내산화의 메커니즘을 특성화하였다. 우리는 내면화의 그들의 기계장치가 주로 직접 전좌7을관련시키는 것을 보여주었습니다. 두 번째 예에서, WRAP 펩타이드는 단백질/단백질 간섭 펩타이드 iCAL36(WRAP-iCAL36)17에 공유하게 되었고, 그 능력은 형광 누설 분석에서 페네타틴(Penetratin-iCAL36), 또 다른 CPP에 결합하였다.
마지막으로, 방법의 장점과 한계는 기술적 관점에서 생물학적 관련성에 대해 모두 논의될 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 형광 누설 분석법은 세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 해결하는 간단하고 빠른 방법입니다. 쉽게 할 수 있으며, 또한 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드 또는 다른 멤브레인 상호 작용 분자 사이의 간접적인 비교를 가능하게합니다. 이 분석이 기준선(LUV 단독으로)과 최대 형광 방출(Triton 조건) 사이의 상대적 값을 제공하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계에 대해서는 일반적으로 LUV?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고의 비판적 검토에 대한 에밀리 호세에게 감사드립니다. 이 작품은 재단 “라 리그 콘트레 르 암”, “퐁디아크 부어 라 레체쉬 쉬르 르 암”, 그리고 “센터 국립 드 라 레체쉬 사이엔티피크”(CNRS)에 의해 지원되었다.
Materials
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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