Updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정
Summary
Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 데모의 주요 목적은 식물 바이오매스 샘플에서 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 상세한 Updegraff 프로토콜을 제공하는 것입니다.
Abstract
셀룰로오스는 광합성및 세포벽의 주요 하중 베어링 성분에 의해 생성되는 지구상에서 가장 풍부한 폴리머이다. 세포벽은 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 생체 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장 및 개발에 중요한 역할을 합니다. 세포벽은 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성됩니다. 최근 식물 세포벽은 2세대 바이오 연료 및 바이오 에너지 생산을 목표로 하고 있습니다. 구체적으로, 식물 세포벽의 셀룰로오스 성분은 셀룰로오스 에탄올의 생산에 사용된다. 바이오매스의 셀룰로오스 함량의 추정은 기본 및 적용 된 세포 벽 연구에 매우 중요합니다. Updegraff 방법은 간단하고 견고하며 식물 바이오매스의 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 가장 널리 사용되는 방법입니다. Updegraff 시약으로 치료시 알코올 불용성 조세포 벽 분획은 헤미셀룰로오스와 리그닌 분획을 제거합니다. 나중에, Updegraff 시약 저항하는 셀룰로오스 분획은 단황 포도당 단위로 셀룰로오스 균합고를 가수분해하기 위하여 황산 처리를 실시한다. 회귀 라인은 포도당의 다양한 농도를 사용하여 개발되고 실험 샘플에서 셀룰로오스 가수 분해시 방출되는 포도당의 양을 추정하는 데 사용된다. 마지막으로, 셀룰로오스 함량은 색칠성 앙위 분석에 의한 포도당 단량의 양을 기준으로 추정된다.
Introduction
셀룰로오스는 1차 세포벽과 이차 세포벽 모두에 존재하는 세포벽의 1차 하중 베어링 성분입니다. 세포벽은 식물 세포를 포위하는 세포외 매트릭스이며 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 매트릭스 단백질로 구성됩니다. 식물 바이오매스의 약 1/3은 셀룰로오스1이며, 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 바이오틱 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장과 개발에 중요한 역할을 합니다. 면 섬유는 95% 셀룰로오스2 함량을 포함하고 있으며, 나무는 식물 종 및 장기 유형에 따라 셀룰로오스의 40 %에서 50 %를 함유하고있습니다3. 셀룰로오스는 β-1,4 글리코시딕 본드4에의해 연결된 포도당 잔류물의 불협화기인 셀로바이오제의 반복 단위로 구성된다. 셀룰로오스 에탄올은 식물 세포벽5에존재하는 셀룰로오스로부터 유래된 포도당으로부터 생산된다. 셀룰로오스 섬유는 각 마이크로 피브릴이 500-15000 포도당 단량제1,6을가진 코어 단위로 작용하는 몇몇 마이크로 피브릴로 구성됩니다. 셀룰로오스 모합합체는 플라즈마 멤브레인 임베디드 셀룰로오스 신타스 복합체(CSC)1,7에의해 합성된다. 개별 셀룰로오스 신타제 A(CESA) 단백질은 글루칸 사슬을 합성하고 인접한 글루칸 사슬은 수소 결합에 의해 연결되어 결정성 셀룰로오스1,8을형성한다. 셀룰로오스는 2개의 우세한 형태, 셀룰로오스 Iα 및 셀룰로오스 Iβ를 네이티브 형태9로여러 결정 형태로 존재한다. 더 높은 식물에서 셀룰로오스는 셀룰로오스 Iβ 형태로 존재하며, 낮은 식물 셀룰로오스는 Iα 형태10,11에존재한다. 전반적으로, 셀룰로오스는 식물 세포벽에 강도와 강성을 부여하는 데 중요한 역할을한다.
1세대 바이오 연료는 주로 옥수수 전분, 지팡이 설탕 및 사탕무 설탕에서 생산되며, 2세대 바이오 연료는 비식품 식물바이오매스 세포벽재료(12)의바이오 연료 생산에 주력하고 있다. 결정성 셀룰로오스 함량의 정확한 추정은 셀룰로오스 생합성 및 세포벽 역학에 대한 근본적인 연구뿐만 아니라 적용 된 바이오 연료 및 바이오 제품 연구에도 중요합니다. 식물 바이오매스의 셀룰로오스 추정에 최적화된 다양한 방법이 개발되고 최적화되어 있으며, Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 셀룰로오스 추정을 위한 첫번째 보고된 방법은 1908년13년에십자가와 베반에 의해 이었습니다. 이 방법은 황산나트륨에 의한 대체 염소화 및 추출 원리에 기초하였다. 그러나, 원래의 변형된 프로토콜뿐만 아니라 크로스 및 베반 방법의 변형된 프로토콜에 의해 얻어진 셀룰로오스는 상당한 양의 자일란과만난(14)에더하여 리그닌의 작은 분수의 오염을 보였다. 셀룰로오스 분획에서 리그닌과 헤미셀룰로스를 제거하기 위한 몇 가지 수정에도 불구하고, 크로스 베반 방법은 셀룰로오스와 함께 상당한 양의 만란을 유지했습니다. 나중에, 쿠르슈너의 방법은 셀룰로오스(15)를추출하기 위해 질산과 에탄올을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 총 리그닌과 펜토산의 75%가 제거되었지만 진정한 셀룰로오스 결과는 크로스와 베반의 염소화 방법에 의해 추정된 것과 동일하다고 명시하였다. 또 다른 방법(Norman 및 Jenkins)은셀룰로오스(16)를추출하기 위해 메탄올 벤젠, 황산나트륨 및 하이포염소산나트륨을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 또한 리그닌의 일부 일부를 유지 (3%) 그리고 셀룰로오스의 정확한 추정으로 이어지는 펜토산의 상당한 금액. 나중에, 키젤과 Semiganowsky는 80% 농축 황산을 사용하여 셀룰로오스에 다른 접근 법을 사용했으며, 가수 분해 감소 된 설탕은 버트 랜드의 방법에 의해 추정되었다17. 두 가지 방법, 왁스맨스와 스티븐스18 과 살로14,19 키셀과 세미 가노우스키의 방법에 따라 개발 된, 또한 이전 방법에 비해 4-5 % 적은 셀룰로오스 함량을 산출20.
Updegraff 방법은 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법은 1969년21년셀룰로오스의 측정을 위해 Updegraff에 의해 처음 기술되었다. Updegraff 방법은 쿠르슈너 방법 (질산 사용), 키셀 및 세미노프스키 방법 (황산을 사용하여 포도당 모노머로 셀룰로오스의 가수 분해)를 통합하고, 포도당 및 결정 셀룰로오스 함량22의간단한 색소 추정을위한 빌스와 실버맨의 반위 분석법을 통합합니다. 이 방법의 원리는 아세트산과 질산(Updegraff 시약)을 사용하여 균질화된 식물 조직에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 것으로, 아세트/질산 내성 셀룰로오스를 더 처리 및 추정을 위한 세포산내성 셀룰로오스를잎입니다(15) 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 셀룰로오스를 포도당 단량체로 분해하기 위해 67%의 황산으로 처리되며, 방출된 포도당 단량제는 안계학적 분석21,23에의해 추정된다. 원래 Updegraff 방법의 몇 가지 수정은 anthrone분석서 (24)에의해 절차 및 셀룰로오스 추정을 단순화하는 데 사용되었다. 광범위하게 이 메서드는 5단계로 나눌 수 있습니다. 1단계에서는 식물 재료가 제조됩니다. 제2상에서, 조세포벽은 식물 세포벽의 핵심 성분이기 때문에 총 바이오매스로부터 분리된다. 나중에, 제 3 단계에서, 셀룰로오스는 Updegraff 시약으로 처리하여 비 셀룰로오스 세포벽 성분으로부터 분리된다. 네 번째 단계에서, 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 황산 치료에 의해 포도당 단량체로 분해된다. 셀룰로오스의 황산 치료는 황산을 가진 포도당 단량제의 반응에서 5-하이드록시메틸푸르랄 화합물의 형성을 초래한다. 마지막으로, 마지막 단계에서, 왕좌는 이전 단계25에서생성된 모피 화합물로 끓여 서 녹색 의 푸른 복합체를 생성한다. 이 왕좌 기반 색법 방법은 드레이우드에 의해 1942 년에 처음 사용되었습니다. Anthrone는 산성 조건하에서 5-하이드록시메틸푸르랄과 같은 펜토스 및 헥소스 탈수 제품의 furfural 화합물을 식별하는 염료입니다. 헥소스를 가진 반응은 펜토스25에비해 강렬한 색상과 더 나은 반응을 생성합니다. 결합된 포도당의 양은 620nm에서 분광계 흡광도에 의해 측정되고 녹색 파란색 복합체의 강도는 시료의 설탕 양에 직접적으로 비례한다. 측정된 흡광도 값은 샘플의 포도당 농도를 계산하기 위해 포도당 표준 곡선 회귀 라인과 비교하였다. 측정된 포도당 함량은 식물 바이오매스의 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
면 섬유는 면씨에서 생산 된 천연 섬유입니다. 면섬유는 섬유 산업에서 광범위한 응용 분야와 높은 결정 셀룰로오스 함량을 가진 ~ 95 % 셀룰로오스 함량2를 가진 단일 셀입니다31. 면 섬유에는 ~95% 셀룰로오스가 함유되어 있으므로, 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 시연하기 위해 면 뿌리 조직을 사용했습니다. 면 뿌리 조직은 결정성 셀룰로오스 함량이 적당히 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 부분적인 지원에 대해 식물및 토양 과학 및 면학과에 감사드립니다.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
Riferimenti
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