Her beskriver vi en murine xenograft model, der funktionelt ligner et Ommaya reservoir hos patienter. Vi udviklede Murine Ommaya til at studere nye terapier for den universelt dødelige leptomeningeal sygdom.
Leptomeningeal sygdom (LMD) er en usædvanlig type centralnervesystemet (CNS) metastaser til cerebral spinalvæske (CSF). De mest almindelige kræftformer, der forårsager LMD er brystkræft og lungekræft og modermærkekræft. Patienter diagnosticeret med LMD har en meget dårlig prognose og generelt overleve for kun et par uger eller måneder. En mulig årsag til den manglende effekt af systemisk behandling mod LMD er den manglende opnåelse af terapeutisk effektive koncentrationer af lægemidler i CSF på grund af en intakt og relativt uigennemtrængelig blod – hjerne barriere (BBB) eller blod-CSF barriere på tværs af choroid plexus. Derfor kan direkte administration af lægemidler intrathecally eller intraventricularly overvinde disse barrierer. Denne gruppe har udviklet en model, der giver mulighed for effektiv levering af terapi (dvs. lægemidler, antistoffer og cellulære behandlingsformer) kronisk og gentagne prøveudtagning af CSF til bestemmelse af lægemiddelkoncentrationer og målmodulering i CSF (når tumormikromiljøet er målrettet mod mus). Modellen er murin svarende til en magnetisk resonans imaging-kompatible Ommaya reservoir, som anvendes klinisk. Denne model, som er fastgjort til kraniet, er blevet udpeget som “Murine Ommaya.” Som et terapeutisk proof of concept blev human epidermal vækstfaktor receptor 2 antistoffer (klon 7.16.4) leveret til CSF via Murine Ommaya til behandling af mus med LMD fra humane epidermal vækstfaktor receptor 2-positiv brystkræft. Murine Ommaya øger effektiviteten af narkotikalevering ved hjælp af en miniatureadgangsport og forhindrer spild af overskydende lægemiddel; det forstyrrer ikke CSF-prøveudtagning til molekylære og immunologiske undersøgelser. Murine Ommaya er nyttig til test af nye terapier i eksperimentelle modeller af LMD.
Leptomeningeal sygdom (LMD) er en aggressiv sen fase metastaser af CNS, hvor tumorceller adgang til CSF og infiltrere overfladen af hjernen og rygmarven1. De mest almindelige kræftformer, der forårsager LMD omfatter dem af bryst og lunge samt modermærkekræft2. LMD resulterer i en række neurologiske symptomer og tegn som hovedpine, kranienervevenner, stiv nakke, og radiculopatier. Prognosen for patienter med LMD er generelt meget dårlig (gennemsnitlig overlevelse måles i uger) og er universelt dødelig3,4,5,6,7. Behandling med kirurgi, stråling, og systemisk kemoterapi er palliativ. Systemisk behandling for LMD kan mislykkes på grund af utilstrækkelig lægemiddelindtrængning i CSF på tværs af en intakt BBB eller blod-CSF barriere på tværs af choroid plexus1.
Derfor kan administration af kræftbehandling (f.eks. lægemidler og antistofbaserede behandlinger, herunder checkpointhæmmere og cellulære terapier) direkte ind i CSF, overvinde denne begrænsning8. Adgang til og prøveudtagning AF EFSR fra patienter er muligt gennem et Ommaya-reservoir, der implanteres under hovedbunden. Denne enhed giver mulighed for administration af kræftmidler (f.eks. methotrexat og trastuzumab) samt prøveudtagning af CSF til diagnostiske undersøgelser (f.eks. den cytologiske diagnose lmd til at overvåge for respons på behandling) uden at udføre en spinal hane. En murine Ommaya reservoir var designet til at efterligne dem, der anvendes klinisk. Reservoiret kræver samling af en adgangsport og afstandsdele og en ændring af musens cannulationsteknik, som gør det muligt for enheden at forblive permanent intakt under hele lægemiddelundersøgelsen. Denne enhed er blevet udpeget som “Murine Ommaya”.
I modsætning til den osmotiske infusionspumpeteknik, som kræver fremstilling af overskydende væskemængder for at prefylde det tomme rum i slangen og kontinuerlig infusion over hyppige injektioner9, minimerer Murine Ommaya spild af lægemiddelopløsninger. Det tillader effektiv administration af flere enkeltdoser af behandlinger på et givet tidspunkt i små mængder (3-7 μL) i CSF ved hjælp af en Hamilton sprøjte, en miniature adgangsport, og en automatisk injektor. I realtid, effekten af test medicin mod LMD kan bestemmes ved billeddannelse. Ved hjælp af denne tilgang, en række kemoterapier, antistoffer, og celle immunterapier (som enkelt eller kombinerede midler) kan testes mod LMD at oversætte in vivo resultater i rationel behandling strategier for patienter. For yderligere at forbedre billeddannelseskapaciteten for en patientafledt xenograft (PDX) model af LMD blev der indgået et samarbejde med en producent om at udvikle en MRI-kompatibel version af Murine Ommaya(Magnetic Resonance Imaging), som ikke kræver nogen samling og er klar til brug. MR-kapacitet er gavnlig, især for PDX-modeller, hvor mængden af cirkulerende tumorceller (CFC’ er) fra CSF undertiden er den begrænsende faktor, og ofte når præmærkning af CFC’er er umulig.
Dette papir beskriver en detaljeret protokol, der begynder med injektion af CFC’er til at gøre mus med LMD . Murine Ommaya er derefter kirurgisk implanteret, og flere lægemiddelbehandling trin via Murine Ommaya udføres. Som et bevis på begrebet for demonstration, en in vivo side-by-side sammenligning blev udført, hvor murin menneskelige epidermal vækstfaktor receptor 2 (Her2) antistof kaldet klon 7.16.4 (den menneskelige ækvivalent af trastuzumab) blev leveret10. Antistoffet er rettet mod Her2+ brystkræftceller enten via Murine Ommaya (direkte målrettet eller intrathecal behandling) eller ved intraperitoneal injektion (systemisk terapi). Resultaterne viste, at mus med LMD, der fik direkte intrathecal immunterapi levede betydeligt længere end dem, der behandles med samme behandling systemisk. CNS-metastaserne hos mus, der blev behandlet via Murine Ommaya, blev næsten fuldstændig regresseret af den tredje dosis i den tredje behandlingsuge, hvilket resulterede i forbedret samlet overlevelse.
Her er Murine Ommaya blevet beskrevet som en pålidelig model, som giver mulighed for gentagen administration af anti-cancer agenter i CSF rummet i prækliniske modeller af LMD og andre CNS-relaterede sygdomme. CSF blev udtaget prøver af mus, mens enheden stadig var fastgjort uden afbrydelse. Denne direkte målrettede terapi xenograft model er et vigtigt skridt i udviklingen og afprøvning rationel behandling strategier for LMD. Tiden fra cisterna magna injektioner til det første tegn på LMD udvikling varierer afhængigt af kræft celletype. LMD og CNS metastaser begynder at tage form omkring 1 eller 2 uger efter CTC podning. Hvis en meget proliferativ kræft celle linje anvendes, Er det muligt, at metastaser kan forekomme i <7 dage. I dette tilfælde kan vascularisering på grund af tumorvækst undertiden gøre implantation af Murine Ommaya udfordrende. En løsning på denne udfordring er at reducere antallet af kræftceller til injektion i CSF rummet, giver mulighed for mere tid før tumor udvikling. Desuden er denne protokol blevet optimeret til at implantere Murine Ommaya senest 72 timer efter cisterna magna injektion for at sikre tilstrækkelig tid til mus til at komme sig efter operationen før den første behandling. Forskere bør beregne vækstraten for CFC'erne i xenograft modeller, før du planlægger behandling regime.
Selv om der er andre direkte intraventrikulære leveringsmetoder, såsom at bruge en osmotisk pumpe system eller en intratracerebroventricular (ICV) bolus injektion, som beskrevet tidligere9, der er flere fordele ved at bruge Murine Ommaya model. For eksempel, en ICV bolus injektion sker i en enkelt levering, mens Murine Ommaya giver mulighed for flere doser af behandling til enhver tid, uanset om det gives som et enkelt middel eller som kombinerede behandlinger. Den osmotiske pumpe er designet til at opretholde i op til 14, 28 eller 42 dage, før pumpen skal udskiftes, og nogle gange oftere, hvis en mindre mus med en mindre pumpe bruges. Ændring af den osmotiske pumpe kræver en kirurgisk procedure, som tilføjer stress til tumorbærende mus. En Murine Ommaya udskiftning er ikke nødvendig for langvarige eksperimenter, så længe enheden forbliver intakt. Det minimerer også potentielle variabilitet, der skyldes at ændre pumpen9. Implanterede Murine Ommayas i forsøgsmusene forblev intakte i mere end 42 dage, og denne varighed tillod for langlivede behandlingsregimer.
Tidligere resultater tyder på, at en pulsatile intermitterende dosering i CSF har bedre effekt mod LMD end en langvarig lægemiddelleveringsproces ved infusion13. Det ville være umuligt at udføre gentagne enkeltdosis injektioner ved hjælp af osmotiske pumpe system. Der er ingen nem måde at skylle den resterende fanget væske ud efter hver injektion. Den osmotiske pumpe er også begrænset til at levere blandinger af kompatible eller enkelte lægemidler og kræver typisk højere mængder lægemiddelpræparat til kontinuerlig infusion. I modsætning hertil er Murine Ommaya designet til nøjagtige mikroindsprøjtninger så lidt som 3 til 7 μL uden at skulle tage højde for døde rum, og der er ingen begrænsning på den type lægemidler, forskere kan bruge, herunder immuncelleterapi. Murine Ommaya minimerer også reagensaffald, hvis en bestemt prøve er dyrebar og maksimerer brugen af denne ressource. For enhver behandling regime, der kræver flere doser af anti-cancer behandlinger, Murine Ommaya er let at bruge, og der er minimal risiko for infektion eller kirurgisk uheld, med de alternative tilgange til gentagne gange at få adgang til CSF kirurgisk eller via gentagen levering med en nål. Murine Ommaya giver forskerne fleksibilitet til at justere lægemiddelkoncentrationer og doseringsfrekvenser og til at vurdere målmodulation og varighed af undersøgelsen i henhold til forskningen af interesse.
En begrænsning af Murine Ommaya er, at forskere kan have svært ved at implantere enheden i mindre mus. Derfor er det bedre at bruge mus, der er mindst 8 til 10 uger gamle. Det er muligt for Murine Ommaya at komme ud under behandlingsforsøget, hvis enheden ikke er fastgjort til kraniet under implantationstrinnene, og limen aftager, eller hvis musene har manipuleret slibende med det. Sidstnævnte scenario forekommer hyppigere, når flere mus blev anbragt i samme bur. Derfor anbefales det at huse ikke mere end to Murine Ommaya-implanterede mus pr. bur i varigheden af behandlingsplanen. Denne protokol blev ændret til at anvende cyanoacrylat sterilt klæbemiddel på afstandsrummet, som viste sig at være den mest effektive lim til at klæbe afstandsrummet til kraniets overflade og forhindre Murine Ommaya i at komme ud. Resultaterne viste, at LMD mus nød godt af direkte intrathecal behandling via Murine Ommaya, med øget samlet overlevelse. Enkelt mikroliter mængder kunne administreres sikkert, uden om BBB, hvilket reducerer mængden af lægemiddelpræparat. Vigtigst er det, at de mus, der blev helbredt for CNS-metastaser fra Her2-antistofimmunterapistudiet, er forblevet sunde.
Et samarbejde med en producent havde til formål at udvikle en MR-kompatibel version af Murine Ommaya til PDX-modellen af LMD. Fordi denne prototype version har en spacer indarbejdet, ingen samling er påkrævet, giver mulighed for bedre tilslutning til kraniet. En begrænsning af denne prototype er, at selv om enheden er MR-kompatibel, genererer den en skygge, hvor enheden indsættes, hvilket reducerer billedets synlighed til kvantificeringsanalyser. Den MRI-kompatible version er et godt alternativ værktøj, når ex vivo CTC-prøveudtagning er en begrænsende faktor, og præmærkningsceller er ikke mulige. Kombinationen af en LMD xenograft model og Murine Ommaya teknik er gavnligt for at studere direkte målrettet lægemiddeleffekt uden om BBB. Resultaterne fra disse in vivo-studier er klinisk relevante for at designe rationelle terapeutiske strategier for patienter med LMD.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson og resten af Comparative Medicine-teamet på University of South Florida for deres tekniske support og vedligeholdelse af vores dyr. Vi takker Instech Laboratories, Inc. for deres indsats med at arbejde sammen med os baseret på vores anmodning om at udvikle en MR-kompatibel Murine Ommaya. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (til K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH10675 (til B. Czerniecki og P. Kalinski), og Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (til P. Forsyth og D. Duckett). Redaktionel bistand blev ydet af Moffitt Cancer Center’s Office of Scientific Writing af Dr. Paul Fletcher og Daley Drucker. Der blev ikke givet nogen kompensation ud over deres almindelige lønninger.
1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |