تجميع وتشغيل جهاز Acoustofluidic لتعزيز تسليم المركبات الجزيئية إلى الخلايا
Summary
يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا عن طريق سونوبوبينيد الناجم عن عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.
Abstract
مطلوب تسليم فعال داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية لمجموعة واسعة من البحوث الطبية الحيوية والتطبيقات العلاجية القائمة على الخلايا. الموجات فوق الصوتية بوساطة سونوبوينج هو تقنية ناشئة للتسليم السريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية. يحدث التجويف عندما يشكل تجويف الفقاعات الدقيقة المملوءة بالغاز مساما عابرة في أغشية الخلايا القريبة ، مما يتيح امتصاصا سريعا للجزيئات الحيوية من السائل المحيط. التقنيات الحالية ل سونوبوبينيشن في المختبر من الخلايا في تعليق محدودة من قبل الإنتاجية البطيئة، والتباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية لكل خلية، وارتفاع التكلفة. لمعالجة هذه القيود، تم تطوير جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يدمج محول الموجات فوق الصوتية في جهاز السائل القائم على PDMS للحث على سونوبوديشن متسقة من الخلايا لأنها تتدفق من خلال القنوات بالاشتراك مع وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية. يتم تصنيع الجهاز باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية لإنتاج رقاقة السائل المستندة إلى PDMS. يتم إرفاق محول قرص بيزو بالموجات فوق الصوتية بالجهاز ويقوده متحكم دقيق. يمكن دمج التجميع داخل علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لمزيد من الحماية. يتم دفع الخلايا والفقاعات الدقيقة من خلال الجهاز باستخدام مضخة حقنة أو مضخة معجبة متصلة بأنابيب PVC. ويتجلى تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية وخلايا سرطان الرئة مع هذا النظام acoustofluidic. بالمقارنة مع نهج العلاج السائبة ، يزيد هذا النظام acoustofluidic الإنتاجية ويقلل من التباين ، مما يمكن أن يحسن طرق معالجة الخلايا لتطبيقات البحوث الطبية الحيوية وتصنيع العلاجات القائمة على الخلايا.
Introduction
وقد استخدمت منصات الفيروسية وغير الفيروسية لتعزيز التسليم الجزيئي للخلايا. التسليم الفيروسي (النقل) هو تقنية شائعة تستخدم في العلاجات القائمة على الخلايا التي تتطلب التعديل الجينومي. وتشمل القيود مع التسليم الفيروسية تولد الغرز المحتملة، والقدرة المعدلة وراثيا محدودة، وتعدد غير مرغوب فيه من العدوى1،2. لذلك ، يتم تطوير تقنيات التسليم الجزيئي غير الفيروسية لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية والبحثية. وتشمل التقنيات الشائعة الميكانيكية والكهربائية والديناميكية المائية، أو استخدام الطاقة القائمة على الليزر لتعزيز امتصاص الجزيئات الحيوية في الخلايا 3. Electroporation هو منصة توصيل جزيئية غير فيروسية شائعة الاستخدام لديها القدرة على إحداث ثقب عابر في غشاء البلازما للتسليم داخل الخلايا للمركبات الجزيئية4و5و6و7و8و9. ومع ذلك ، فإن ثقب عابر لغشاء البلازما هو عملية عشوائية ويعتمد الامتصاص الجزيئي عبر الكهربوئس بشكل عام على الانتشار السلبي عبر مسام الغشاء العابر4و7و8.
وهناك طريقة بديلة هي استخدام الموجات فوق الصوتية لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا عن طريق التجويف من وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية (أي الفقاعات الصغيرة المليئة بالغاز). التجويف Microbubble يحفز آثار microstreaming في وسائل الإعلام المحيطة بها والتي يمكن أن تسبب ثقب عابرة من أغشية البلازما القريبة (“سونوبوبينيشن”) السماح امتصاص سريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية عن طريق آليات النقل السلبي أو النشط10،11،12. Sonoporation هو تقنية فعالة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا ، ولكن هذا النهج غالبا ما يتطلب معدات باهظة الثمن وطرق العلاج السائبة التي تحد منها انخفاض الإنتاجية وارتفاع التباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية13. لمعالجة هذه القيود، يجري حاليا تطوير أجهزة acoustofluidic، التي تمكن من وجود سونوبوينيشن متسق للخلايا المعلقة.
Acoustofluidics هو مجال آخذ في التوسع يدمج تقنيات الموجات فوق الصوتية والموجات الدقيقة لمجموعة واسعة من التطبيقات. وقد سبق استخدام هذا النهج لفصل الجسيمات عن طريق تطبيق الطاقة المستمرة بالموجات فوق الصوتية للحث على الموجات الصوتية الدائمة داخل القنوات السائلة14،15،16،17. يتم فرز الجسيمات نحو أجزاء مختلفة من الجهاز استنادا إلى مجموعة متنوعة من الخصائص مثل حجم الجسيمات والكثافة والضغوط بالنسبة إلى المتوسط16. كما أن تقنيات Acoustofluidic قيد التطوير لتمكين التسليم الجزيئي السريع لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا لتطبيقات البحث وتصنيع علاجات الخلايا18. في الآونة الأخيرة، أظهرنا تعزيز التسليم الجزيئي لكريات الدم الحمراء باستخدام جهاز acoustofluidic المستندة إلى PDMS19. في منصة acoustofluidic ، يمكن التلاعب ديناميات الخلية والفقاعات الدقيقة للحث على التفاعلات المادية التي تمكن من تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية. يمكن زيادة كفاءة واتساق التسليم الجزيئي داخل الخلايا من خلال تحسين المسافة بين الخلايا والفقاعات الدقيقة.
أحد التطبيقات الهامة ل aoustofluidic بوساطة سونوبوديشن ينطوي على نقل الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية الأولية. العلاجات المناعية على أساس نقل الخلايا التائية بالتبني، مثل العلاج مستقبلات مستضد Chimeric T الخلية (CAR T)، تظهر بسرعة لعلاج مختلف الأمراض، بما في ذلك السرطان والفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية20. كان العلاج CAR T فعالا بشكل خاص في مرضى سرطان الدم الليمفاوي الحاد للأطفال (ALL) ، مع معدلات مغفرة كاملة من 70-90٪21. ومع ذلك، يعتمد تصنيع الخلايا التائية لهذه العلاجات بشكل عام على النقل الفيروسي الذي يحد منه تكوين الغرز المحتمل، وأوقات المعالجة الطويلة، والتحديات المتمثلة في تقديم الجزيئات الحيوية غير الوراثية مثل البروتينات أو الجزيئات الصغيرة1. يمكن لطرق التوصيل الجزيئي بوساطة Acoustofluidic التغلب على هذه القيود وتحسين تصنيع علاجات الخلايا التائية.
وثمة تطبيق هام آخر لمسألة السونوبونيد بوساطة ألوستوفلويديك ينطوي على تسليم المركبات الحافظة داخل الخلايا، مثل التريهالوز، التي تحمي الخلايا أثناء التجميد وإزالة الكبريت. يتم إنتاج تريهالوز من قبل بعض الكائنات الحية في الطبيعة ويساعدهم على تحمل التجميد و المجفف عن طريق حماية أغشيتهم الخلوية22،23. ومع ذلك ، لا تنتج التريهالوز من قبل خلايا الثدييات وغير منفذة لأغشية خلايا الثدييات. لذلك ، فإن تقنيات التسليم الجزيئي الفعالة ، مثل السونوبوديشن ، ضرورية من أجل تحقيق مستويات تريهالوز كافية داخل الخلايا المطلوبة لحماية الأغشية الخلوية الداخلية. ويجري حاليا تطوير هذا النهج من أجل الحفاظ الجاف على أنواع مختلفة من الخلايا.
يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لتجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة نسبيا مدفوعا بتحكم دقيق. وتستخدم عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية للحث على ال سونوبوليشن داخل القنوات السائلة وتمكين التسليم الجزيئي السريع لأنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا السرطانية. يمكن استخدام هذا النظام acoustofluidic لمجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية، ويمكن أيضا أن تكون مفيدة كنظام نموذجي لتقييم أساليب سونوبوينج لتحسين عمليات تصنيع العلاج بالخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يعزز التسليم داخل الخلايا للجزيئات الحيوية لتطبيقات البحث. هناك العديد من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند تجميع وتشغيل هذا النظام. الجهاز acoustofluidic هو ملفقة في PDMS، وهو مادة متوافقة بيولوجيا التي يمكن بسهولة مصبوب مع أبعا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (#1827521 #1827521 #1450370) والمعاهد الوطنية للصحة (U01HL127518). تم توفير خدمات التصوير الضوئي من قبل جامعة لويز مايكرو / نانو مركز التكنولوجيا.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
Riferimenti
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
