細胞への分子化合物の送達を強化するためのアキュトー流体デバイスの組立と操作
Summary
このプロトコルは、超音波造影剤によって誘発されるソノポレーションを介して細胞に迅速に分子送達するための低コストのアユースト流体デバイスの組み立ておよび動作を記述する。
Abstract
生体内での効率的な送達は、幅広い生物医学研究や細胞ベースの治療用途に必要です。超音波介在性ソノポレーションは、生体分子の細胞内送達を迅速に行うための新たな技術です。ソノポレーションは、ガスで満たされたマイクロバブルのキャビテーションが近くの細胞膜で一過性の細孔を形成し、周囲の流体からの生体分子の迅速な取り込みが可能になると起こります。懸濁液中の細胞のインビトロ超音波処理のための現在の技術は、遅いスループット、各細胞の超音波暴露条件の変動、および高コストによって制限される。これらの制限に対処するために、超音波造影剤と組み合わせてチャネルを流れる細胞の一貫したソノポレーションを誘導するために、PDMSベースの流体デバイスに超音波トランスデューサを統合する低コストのアクロス流体デバイスが開発されました。この装置は、PDMSベースの流体チップを製造するために標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して製造される。超音波ピエゾディスクトランスデューサは、デバイスに取り付けられ、マイクロコントローラによって駆動されます。アセンブリは3Dプリントされたケースの内部に組み込まれ、保護を強化することができます。細胞およびマイクロバブルは、シリンジポンプまたはPVCチューブに接続された蠕動ポンプを使用してデバイスを介して押し出されます。生体分子のヒトT細胞および肺癌細胞への送達が増強され、このアバイオス流体系で実証される。一括治療アプローチと比較して、このアクロス流体システムは、スループットを増加させ、変動性を低減し、生物医学研究アプリケーションおよび細胞ベースの治療薬の製造のための細胞処理方法を改善することができます。
Introduction
ウイルスおよび非ウイルスプラットフォームは、細胞への分子送達を増強するために利用されてきた。ウイルス送達(伝達)は、ゲノム修飾を必要とする細胞ベースの治療法で利用される一般的な技術である。ウイルス送達に関する制限は、潜在的な挿入突然変異誘発、限られたトランスジェニック容量、および感染の望ましくない多重度1、2を含む。そのため、非ウイルス分子送達技術は、幅広い生物医学および研究用途に向けて開発中である。一般的な技術は、機械的、電気的、流体力学、または細胞3への生体分子の取り込みを強化するためのレーザーベースのエネルギーの使用を含む。エレクトロポレーションは、分子化合物4、5、6、7、8、9の細胞内送達のために、細胞膜中の一過性穿孔を誘導する能力を有する一般的に使用される非ウイルス性分子送達プラットフォームである。しかしながら、電気ポレーションを介した確率的プロセスおよび分子取り込みである形質膜の過渡性穿孔は、一般的に、一過性膜細孔4、7、8を横切る受動的拡散に依存する。
別の方法は、超音波造影剤(すなわち、ガス充填マイクロバブル)のキャビテーションを介して細胞内分子送達を増強するための超音波の利用である。マイクロバブルキャビテーションは、周囲の媒体にマイクロストリーミング効果を誘導し、近くの血漿膜の過渡穿圧(「ソノポレーション」)を引き起こす可能性があり、受動または活動的な輸送機構10、11、12を介した生体分子の急速な細胞内取り込みを可能にする。ソノポレーションは細胞への迅速な分子送達に有効な技術であるが、このアプローチは、多くの場合、超音波暴露条件13における低いスループットおよび高い変動性によって制限される高価な機器およびバルク処理方法を必要とする。これらの制限に対処するために、懸濁液中の細胞の一貫したソノポレーションを可能にするアクロプト流体デバイスは、現在開発中です。
アクロウス流体は、超音波とマイクロ流体技術を幅広い用途に統合した拡大分野です。このアプローチは、流体チャネル14、15、16、17内の立ち位置音響波を誘導するために連続的な超音波エネルギーを適用することによって粒子分離のために以前に使用されてきた。パーティクルは、粒子サイズ、密度、および媒体16に対する圧縮性などのさまざまな特性に基づいて、デバイスの異なる部分に向かってソートされる。アキュスト流体技術は、細胞療法18の研究用途および製造のための様々な細胞タイプへの迅速な分子送達を可能にする開発中である。最近、PDMS系アユースト流体装置19を用いて赤血球への分子送達を増強することを実証した。アシュー流体プラットフォームでは、細胞とマイクロバブルのダイナミクスを操作して、生体分子の送達を強化する物理的相互作用を誘導することができます。細胞内の分子送達の効率と一貫性は、細胞とマイクロバブルの距離を最適化することによって、潜在的に増加させることができます。
アクロス流体媒介ソノポローションの重要なアプリケーションの1つは、生体分子を原発ヒトT細胞に輸送することを含む。キメラ抗原受容体T細胞(CAR T)療法などの養子T細胞転移に基づく免疫療法は、HIV20などの癌およびウイルスを含む様々な疾患の治療のために急速に出現している。CAR T療法は小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)患者において特に有効であり、完全寛解率は70-90%21である。しかしながら、これらの治療法のT細胞製造は一般に、潜在的な挿入突然変異誘発によって制限されるウイルス伝達に依存し、長い処理時間、およびタンパク質または小分子などの非遺伝的生体分子を送達するという課題1。アキュスト流体媒介性分子送達方法は、これらの制限を克服し、T細胞療法の製造を改善する可能性がある。
アソウス流体媒介ソノポレーションのもう一つの重要なアプリケーションは、凍結および乾燥中に細胞を保護するトレハロースのような防腐剤化合物の細胞内送達を含む。トレハロースは、自然の中でいくつかの生物によって生成され、彼らは彼らの細胞膜22、23を保護することによって凍結と乾燥を許容するのに役立ちます。しかし、トレハロースは哺乳動物細胞によって産生されず、哺乳類細胞膜に対して不浸透性である。したがって、内部細胞膜を保護するために必要な十分な細胞内トレハロースレベルを達成するためには、ソノポレーションなどの効果的な分子送達技術が必要です。このアプローチは、現在、様々な細胞タイプの乾燥保存のために開発中である。
このプロトコルは、マイクロコントローラによって駆動される比較的低コストのアクロス流体システムの組立と動作の詳細な説明を提供します。超音波造影剤は、流体チャネル内のソノポレーションを誘導し、T細胞および癌細胞を含む様々な細胞タイプへの迅速な分子送達を可能にするために利用される。このアインクルード流体システムは、様々な研究用途に使用することができ、また、改善された細胞療法の製造プロセスのためのソノポレーション方法を評価するためのプロトタイプシステムとして有用であり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、研究用途のための生体分子の細胞内送達を増強する低コストのアクロス流体系の組み立てと動作を記述する。このシステムを組み立てて操作する際に考慮すべき重要な要素がいくつかあります。このアヌースト流体デバイスはPDMSで製造されており、これは一貫したチャネル寸法27で容易に成形できる生体適合性材料である。装置チャネルは培養細胞との?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団(#1827521、#1827521、#1450370)と国立衛生研究所(U01HL127518)からの資金提供によって部分的に支援されました。フォトリソグラフィーサービスは、ルイビル大学マイクロ/ナノテクノロジーセンターによって提供されました。
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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