Assemblage en werking van een Acoustofluidic-apparaat voor verbeterde levering van moleculaire verbindingen aan cellen
Summary
Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van een goedkoop acoustofluidisch apparaat voor snelle moleculaire levering aan cellen via sonoporatie geïnduceerd door ultrasone contrastmiddelen.
Abstract
Efficiënte intracellulaire toediening van biomoleculen is vereist voor een breed scala aan biomedisch onderzoek en celgebaseerde therapeutische toepassingen. Echografie-gemedieerde sonoporatie is een opkomende techniek voor snelle intracellulaire toediening van biomoleculen. Sonoporatie treedt op wanneer cavitatie van met gas gevulde microbubbels voorbijgaande poriën vormt in nabijgelegen celmembranen, waardoor een snelle opname van biomoleculen uit de omringende vloeistof mogelijk is. De huidige technieken voor in vitro sonoporatie van cellen in suspensie worden beperkt door langzame doorvoer, variabiliteit in de ultrasone blootstellingsomstandigheden voor elke cel en hoge kosten. Om deze beperkingen aan te pakken, is een goedkoop acoustofluidic apparaat ontwikkeld dat een ultrasone transducer integreert in een pdms-gebaseerd vloeibaar apparaat om consistente sonoporatie van cellen te induceren terwijl ze door de kanalen stromen in combinatie met ultrasone contrastmiddelen. Het apparaat is vervaardigd met behulp van standaard fotolithografietechnieken om de op PDMS gebaseerde vloeistofchip te produceren. Een ultrasone piëzoschijftransducer wordt aan het apparaat bevestigd en aangedreven door een microcontroller. De montage kan worden geïntegreerd in een 3D-geprinte behuizing voor extra bescherming. Cellen en microbubbels worden door het apparaat geduwd met behulp van een spuitpomp of een peristaltische pomp die is aangesloten op PVC-buizen. Verbeterde levering van biomoleculen aan menselijke T-cellen en longkankercellen wordt aangetoond met dit acoustofluidische systeem. In vergelijking met bulkbehandelingsbenaderingen verhoogt dit acoustofluidische systeem de doorvoer en vermindert het de variabiliteit, wat de celverwerkingsmethoden voor biomedische onderzoekstoepassingen en de productie van celgebaseerde therapieën kan verbeteren.
Introduction
Virale en niet-virale platforms zijn gebruikt om moleculaire levering aan cellen te verbeteren. Virale toediening (transductie) is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt in celgebaseerde therapieën die genomische modificatie vereisen. Beperkingen met virale toediening omvatten potentiële insertie mutagenese, beperkte transgene capaciteit en ongewenste veelheid van infectie1,2. Daarom zijn niet-virale moleculaire toedieningstechnieken in ontwikkeling voor een breed scala aan biomedische en onderzoekstoepassingen. Veel voorkomende technieken zijn mechanische, elektrische, hydrodynamische of het gebruik van lasergebaseerde energie om de opname van biomoleculen in cellen 3te verbeteren. Elektroporatie is een veelgebruikt niet-viraal moleculair afgifteplatform dat de mogelijkheid heeft om voorbijgaande perforatie in het plasmamembraan te induceren voor intracellulaire levering van moleculaire verbindingen4,5,6,7,8,9. De transiënte perforatie van het plasmamembraan is echter een stochastisch proces en de moleculaire opname via elektroporatie is over het algemeen afhankelijk van passieve diffusie over de voorbijgaande membraanporiën4,7,8.
Een alternatieve methode is het gebruik van ultrageluid voor verbeterde intracellulaire moleculaire toediening via cavitatie van ultrasone contrastmiddelen (d.w.z. met gas gevulde microbubbels). Microbubble cavitatie induceert microstreaming-effecten in de omringende media die voorbijgaande perforatie van nabijgelegen plasmamembranen (“sonoporatie “) kunnen veroorzaken, waardoor een snelle intracellulaire opname van biomoleculen via passieve of actieve transportmechanismen mogelijk is10,11,12. Sonoporatie is een effectieve techniek voor de snelle moleculaire levering aan cellen, maar deze aanpak vereist vaak dure apparatuur en bulkbehandelingsmethoden die worden beperkt door een lagere doorvoer en een hogere variabiliteit in ultrasone blootstellingsomstandigheden13. Om deze beperkingen aan te pakken, zijn acoustofluidische apparaten, die consistente sonoporatie van cellen in suspensie mogelijk maken, momenteel in ontwikkeling.
Acoustofluidics is een groeiend veld dat ultrasone en microfluïdische technologieën integreert voor een breed scala aan toepassingen. Deze benadering is eerder gebruikt voor deeltjesscheiding door continue ultrasone energie toe te passen om staande akoestische golven binnen de vloeistofkanalen14,15,16,17te induceren . Deeltjes worden gesorteerd naar verschillende delen van het apparaat op basis van een verscheidenheid aan eigenschappen, zoals deeltjesgrootte, dichtheid en samendrukbaarheid ten opzichte van het medium16. Acoustofluidische technologieën zijn ook in ontwikkeling om een snelle moleculaire levering aan een verscheidenheid van celtypes voor onderzoekstoepassingen en productie van celtherapieën mogelijk te maken18. Onlangs hebben we een verbeterde moleculaire levering aan erytrocyten aangetoond met behulp van een pdms-gebaseerd acoustofluidisch apparaat19. In het acoustofluidische platform kan cel- en microbubbeldynamiek worden gemanipuleerd om fysieke interacties te induceren die een verbeterde levering van biomoleculen mogelijk maken. De efficiëntie en consistentie van intracellulaire moleculaire toediening kan mogelijk worden verhoogd door de afstand tussen cellen en microbubbels te optimaliseren.
Een belangrijke toepassing voor acoustofluidic-gemedieerde sonoporatie omvat het transport van biomoleculen naar primaire menselijke T-cellen. Immunotherapieën op basis van adoptieve T-celoverdracht, zoals Chimeric Antigen Receptor T cell (CAR T) therapie, zijn snel in opkomst voor de behandeling van verschillende ziekten, waaronder kanker en virussen zoals HIV20. CAR T-therapie is bijzonder effectief geweest bij pediatrische acute lymfoblastische leukemie (ALL) patiënten, met volledige remissiepercentages van 70-90%21. De productie van T-cellen voor deze therapieën hangt echter over het algemeen af van virale transductie, die wordt beperkt door potentiële insertie mutagenese, lange verwerkingstijden en uitdagingen van het leveren van niet-genetische biomoleculen zoals eiwitten of kleine moleculen1. Acoustofluidic-gemedieerde moleculaire leveringsmethoden kunnen mogelijk deze beperkingen overwinnen en de productie van T-celtherapieën verbeteren.
Een andere belangrijke toepassing voor acoustofluidic-gemedieerde sonoporatie omvat intracellulaire levering van conserveermiddelen, zoals trehalose, die cellen beschermen tijdens bevriezing en uitdroging. Trehalose wordt geproduceerd door sommige organismen in de natuur en helpt hen bevriezing en uitdroging te verdragen door hun cellulaire membranen te beschermen22,23. Trehalose wordt echter niet geproduceerd door zoogdiercellen en is ondoordringbaar voor zoogdiercelmembranen. Daarom zijn effectieve moleculaire toedieningstechnieken, zoals sonoporatie, nodig om voldoende intracellulaire trehaloseniveaus te bereiken die nodig zijn om interne cellulaire membranen te beschermen. Deze aanpak is momenteel in ontwikkeling voor droge conservering van verschillende celtypen.
Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de assemblage en werking van een relatief goedkoop acoustofluidisch systeem aangedreven door een microcontroller. Ultrasone contrastmiddelen worden gebruikt om sonoporatie in de vloeibare kanalen te induceren en een snelle moleculaire levering aan verschillende celtypen mogelijk te maken, waaronder T-cellen en kankercellen. Dit acoustofluidic systeem kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van onderzoekstoepassingen en kan ook nuttig zijn als een prototype systeem om sonoporatie methoden voor verbeterde celtherapie productieprocessen te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van een goedkoop acoustofluidisch systeem dat de intracellulaire levering van biomoleculen voor onderzoekstoepassingen verbetert. Er zijn verschillende belangrijke factoren waarmee u rekening moet houden bij het assembleren en bedienen van dit systeem. Het acoustofluidische apparaat is vervaardigd in PDMS, een biocompatibel materiaal dat gemakkelijk kan worden gevormd met consistente kanaalafmetingen27. De apparaatkanalen kunnen voorafgaand aan de a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door financiering van de National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) en de National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolithografiediensten werden geleverd door het University of Louisville Micro/Nano Technology Center.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
Riferimenti
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
