Montering og drift av en acoustofluidisk enhet for forbedret levering av molekylære forbindelser til celler
Summary
Denne protokollen beskriver montering og drift av en rimelig acoustofluidic enhet for rask molekylær levering til celler via sonoporasjon indusert av ultralydkontrastmidler.
Abstract
Effektiv intracellulær levering av biomolekyler er nødvendig for et bredt spekter av biomedisinsk forskning og cellebaserte terapeutiske anvendelser. Ultralydmediert sonoporasjon er en ny teknikk for rask intracellulær levering av biomolekyler. Sonoporasjon oppstår når kavitasjon av gassfylte mikrobobler danner forbigående porer i nærliggende cellemembraner, noe som muliggjør rask opptak av biomolekyler fra den omkringliggende væsken. Dagens teknikker for in vitro sonoporation av celler i suspensjon er begrenset av langsom gjennomstrømning, variasjon i ultralydeksponeringsforholdene for hver celle og høye kostnader. For å løse disse begrensningene er det utviklet en rimelig acoustofluidisk enhet som integrerer en ultralydtransduser i en PDMS-basert fluidisk enhet for å indusere konsistent sonoporasjon av celler når de strømmer gjennom kanalene i kombinasjon med ultralydkontrastmidler. Enheten er fremstilt ved hjelp av standard fotolittografiteknikker for å produsere den PDMS-baserte fluidbrikken. En ultralyd piezo disktransduser er festet til enheten og drevet av en mikrokontroller. Monteringen kan integreres inne i et 3D-trykt etui for ekstra beskyttelse. Celler og mikrobobler skyves gjennom enheten ved hjelp av en sprøytepumpe eller en peristaltisk pumpe koblet til PVC-rør. Forbedret levering av biomolekyler til humane T-celler og lungekreftceller er demonstrert med dette acoustofluidiske systemet. Sammenlignet med bulkbehandlingsmetoder øker dette acoustofluidiske systemet gjennomstrømning og reduserer variasjon, noe som kan forbedre cellebehandlingsmetoder for biomedisinske forskningsapplikasjoner og produksjon av cellebaserte terapeutiske midler.
Introduction
Virale og ikke-virale plattformer har blitt brukt til å forbedre molekylær levering til celler. Viral levering (transduksjon) er en vanlig teknikk som brukes i cellebaserte terapier som krever genomisk modifikasjon. Begrensninger med viral levering inkluderer potensiell innsettingsmutagenese, begrenset transgen kapasitet og uønsket multiplisitet av infeksjon1,2. Derfor er ikke-virale molekylære leveringsteknikker under utvikling for et bredt spekter av biomedisinske og forskningsapplikasjoner. Vanlige teknikker inkluderer mekanisk, elektrisk, hydrodynamisk eller bruk av laserbasert energi for å forbedre opptaket av biomolekyler i celle 3. Elektroporasjon er en vanlig brukt ikke-viral molekylær leveringsplattform som har evnen til å indusere forbigående perforering i plasmamembranen for intracellulær levering av molekylære forbindelser4,5,6,7,8,9. Imidlertid er den forbigående perforeringen av plasmamembranen en stokastisk prosess, og molekylært opptak via elektroporasjon er generelt avhengig av passiv diffusjon over de forbigående membranporene4,7,8.
En alternativ metode er utnyttelse av ultralyd for forbedret intracellulær molekylær levering via kavitasjon av ultralydkontrastmidler (dvs. gassfylte mikrobobler). Mikroboblekavitasjon induserer mikrostreamingeffekter i de omkringliggende mediene som kan forårsake forbigående perforering av nærliggende plasmamembraner (“sonoporasjon”) som tillater rask intracellulært opptak av biomolekyler via passive eller aktive transportmekanismer10,11,12. Sonoporasjon er en effektiv teknikk for rask molekylær levering til celler, men denne tilnærmingen krever ofte dyrt utstyr og bulkbehandlingsmetoder som er begrenset av lavere gjennomstrømning og høyere variasjon i ultralydeksponeringsforhold13. For å løse disse begrensningene er acoustofluidic enheter, som muliggjør konsekvent sonoporasjon av celler i suspensjon, for tiden under utvikling.
Acoustofluidics er et ekspanderende felt som integrerer ultralyd og mikrofluidisk teknologi for et bredt spekter av applikasjoner. Denne tilnærmingen har tidligere blitt brukt til partikkelseparasjon ved å bruke kontinuerlig ultralydenergi for å indusere stående akustiske bølger i de fluidiske kanalene14,15,16,17. Partikler sorteres mot ulike deler av enheten basert på en rekke egenskaper, for eksempel partikkelstørrelse, tetthet og komprimerbarhet i forhold til medium16. Acoustofluidic teknologier er også i utvikling for å muliggjøre rask molekylær levering til en rekke celletyper for forskningsapplikasjoner og produksjon av celleterapier18. Nylig demonstrerte vi forbedret molekylær levering til erytrocytter ved hjelp av en PDMS-basert acoustofluidisk enhet19. I den acoustofluidiske plattformen kan celle- og mikrobobbledynamikk manipuleres for å indusere fysiske interaksjoner som muliggjør forbedret levering av biomolekyler. Effektiviteten og konsistensen av intracellulær molekylær levering kan potensielt økes ved å optimalisere avstanden mellom celler og mikrobobler.
En viktig anvendelse for acoustofluidisk mediert sonoporasjon innebærer transport av biomolekyler til primære menneskelige T-celler. Immunterapier basert på adoptiv T-celleoverføring, som Chimeric Antigen Receptor T-celle (CAR T) terapi, dukker raskt opp for behandling av ulike sykdommer, inkludert kreft og virus som HIV20. CAR T-behandling har vært spesielt effektiv hos pediatriske akutte lymfoblastiske leukemipasienter (ALL), med en fullstendig remisjonsrate på 70-90%21. T-celleproduksjon for disse terapiene avhenger imidlertid generelt av viral transduksjon som er begrenset av potensiell innsettingsmutagenese, lange behandlingstider og utfordringer med å levere ikke-genetiske biomolekyler som proteiner eller småmolekyler 1. Acoustofluidic-medierte molekylære leveringsmetoder kan potensielt overvinne disse begrensningene og forbedre produksjonen av T-celleterapier.
En annen viktig anvendelse for acoustofluidic-mediert sonoporation innebærer intracellulær levering av konserveringsmidler, for eksempel trehalose, som beskytter celler under frysing og desiccation. Trehalose produseres av noen organismer i naturen og hjelper dem med å tolerere frysing og uttørking ved å beskytte sine cellulære membraner22,23. Trehalose produseres imidlertid ikke av pattedyrceller og er ugjennomtrengelig for pattedyrcellemembraner. Derfor er effektive molekylære leveringsteknikker, som sonoporasjon, nødvendige for å oppnå tilstrekkelige intracellulære trehalosenivåer som kreves for å beskytte interne cellulære membraner. Denne tilnærmingen er for tiden under utvikling for tørr bevaring av ulike celletyper.
Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av montering og drift av et relativt rimelig acoustofluidisk system drevet av en mikrokontroller. Ultralydkontrastmidler brukes til å indusere sonoporasjon i de fluidiske kanalene og muliggjør rask molekylær levering til ulike celletyper, inkludert T-celler og kreftceller. Dette acoustofluidiske systemet kan brukes til en rekke forskningsapplikasjoner og kan også være nyttig som et prototypesystem for å evaluere sonoporasjonsmetoder for forbedrede celleterapiproduksjonsprosesser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver montering og drift av et rimelig acoustofluidisk system som forbedrer intracellulær levering av biomolekyler for forskningsapplikasjoner. Det er flere viktige faktorer du må vurdere når du monterer og bruker dette systemet. Den acoustofluidiske enheten er fremstilt i PDMS, som er et biokompatibelt materiale som enkelt kan formes med konsistente kanaldimensjoner27. Enhetskanalene kan skylles med 15 ml 70% etanoloppløsning før acoustofluidisk behandling for å øke s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) og National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolittografitjenester ble levert av University of Louisville Micro/Nano Technology Center.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
Riferimenti
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
