Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células
Summary
Este protocolo describe el montaje y la operación de un dispositivo acoustofluidic de bajo costo para la entrega molecular rápida a las células vía el sonoporation inducido por los agentes del contraste del ultrasonido.
Abstract
La entrega intracelular eficiente de biomoléculas es necesaria para una amplia gama de investigaciones biomédicas y aplicaciones terapéuticas basadas en células. el sonoporation Ultrasonido-mediado es una técnica emergente para la entrega intracelular rápida de biomoléculas. La sonoporación se produce cuando la cavitación de microburbujas llenas de gas forma poros transitorios en las membranas celulares cercanas, lo que permite una rápida absorción de biomoléculas del fluido circundante. Las técnicas actuales para la sonoporación in vitro de células en suspensión están limitadas por el rendimiento lento, la variabilidad en las condiciones de exposición al ultrasonido para cada célula y el alto costo. Para abordar estas limitaciones, se ha desarrollado un dispositivo acoustofluidic de bajo costo que integra un transductor de ultrasonido en un dispositivo fluídico basado en PDMS para inducir la sonoporación constante de las células a medida que fluyen a través de los canales en combinación con agentes de contraste de ultrasonido. El dispositivo se fabrica utilizando técnicas de fotolitografía estándar para producir el chip fluídico basado en PDMS. Un transductor de disco piezoelécrico de ultrasonido está conectado al dispositivo y accionado por un microcontrolador. El conjunto se puede integrar dentro de una caja impresa en 3D para mayor protección. Las células y las microburbujas se empujan a través del dispositivo utilizando una bomba de jeringa o una bomba peristáltica conectada a tubos de PVC. La entrega aumentada de biomoléculas a las células de T humanas y a las células cancerosas del pulmón se demuestra con este sistema acoustofluidic. En comparación con los enfoques de tratamiento a granel, este sistema acoustofluidic aumenta el rendimiento y reduce la variabilidad, lo que puede mejorar los métodos de procesamiento celular para aplicaciones de investigación biomédica y la fabricación de terapias basadas en células.
Introduction
Las plataformas virales y no virales se han utilizado para mejorar la entrega molecular a las células. La entrega viral (transducción) es una técnica común utilizada en terapias basadas en células que requieren modificación genómica. Las limitaciones con la entrega viral incluyen mutagénesis de inserción potencial, capacidad transgénica limitada, y multiplicidad no deseada de infección1,2. Por lo tanto, las técnicas de administración molecular no viral están en desarrollo para una amplia gama de aplicaciones biomédicas y de investigación. Las técnicas comunes incluyen mecánica, eléctrica, hidrodinámica, o el uso de energía basada en láser para mejorar la absorción de biomoléculas en las células 3. La electroporación es una plataforma de administración molecular no viral de uso común que tiene la capacidad de inducir perforación transitoria en la membrana plasmática para la entrega intracelular de compuestos moleculares4,5,6,7,8,9. Sin embargo, la perforación transitoria de la membrana plasmática es un proceso estocástico y la absorción molecular a través de la electroporación es generalmente dependiente de la difusión pasiva a través de los poros transitorios de la membrana4,7,8.
Un método alternativo es la utilización del ultrasonido para la entrega molecular intracelular aumentada vía la cavitación de los agentes del contraste del ultrasonido (es decir, microburbujas gas-llenadas). La cavitación de microburbujas induce efectos de microflujo en los medios circundantes que pueden causar perforación transitoria de membranas plasmáticas cercanas (“sonoporación”) permitiendo una rápida absorción intracelular de biomoléculas a través de mecanismos de transporte pasivos o activos10,11,12. La sonoporación es una técnica eficaz para la entrega molecular rápida a las células, pero este enfoque a menudo requiere equipos costosos y métodos de tratamiento a granel que están limitados por un menor rendimiento y una mayor variabilidad en las condiciones de exposición al ultrasonido13. Para abordar estas limitaciones, los dispositivos acoustofluidic, que permiten la sonoporación constante de células en suspensión, están actualmente en desarrollo.
Acoustofluidics es un campo en expansión que integra tecnologías de ultrasonido y microfluídica para una amplia variedad de aplicaciones. Este enfoque se ha utilizado previamente para la separación de partículas mediante la aplicación de energía de ultrasonido continuo para inducir ondas acústicas estacionarias dentro de los canales fluídicos14,15,16,17. Las partículas se clasifican hacia diferentes partes del dispositivo en función de una variedad de propiedades, como el tamaño de partícula, la densidad y la compresibilidad en relación con el medio16. También se están elaborando tecnologías acostofluídicas que permiten la rápida entrega molecular a una variedad de tipos de células para aplicaciones de investigación y fabricación de terapias celulares18. Recientemente, demostramos una mayor entrega molecular a los eritrocitos utilizando un dispositivo acoustofluidic basado en PDMS19. En la plataforma acoustofluidic, la dinámica de la célula y de la microburbuja se puede manipular para inducir las interacciones físicas que permiten la entrega mejorada de biomoléculas. La eficiencia y la consistencia de la entrega molecular intracelular pueden aumentarse potencialmente optimizando la distancia entre las células y las microburbujas.
Un uso importante para el sonoporation acoustofluidic-mediado implica el transporte de biomoléculas en las células de T humanas primarias. Las inmunoterapias basadas en la transferencia adoptiva de células T, como la terapia con células T del receptor de antígeno quimérico (CAR T), están surgiendo rápidamente para el tratamiento de diversas enfermedades, incluido el cáncer y virus como el VIH20. La terapia CON T Y HA SIDO particularmente eficaz en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda (LLA), con tasas de remisión completa del 70-90%21. Sin embargo, la fabricación de células T para estas terapias generalmente depende de la transducción viral, que está limitada por la mutagénesis de inserción potencial, los largos tiempos de procesamiento y los desafíos de la entrega de biomoléculas no genéticas como proteínas o moléculas pequeñas1. Los métodos moleculares mediados por Acoustofluidic pueden potencialmente superar estas limitaciones y mejorar la fabricación de terapias de células T.
Otra aplicación importante para la sonoporación mediada por acoustofluidic implica la entrega intracelular de compuestos conservantes, como la trehalosa, que protegen las células durante la congelación y la desecación. La trehalosa es producida por algunos organismos en la naturaleza y les ayuda a tolerar la congelación y la desecación protegiendo sus membranas celulares22,23. Sin embargo, la trehalosa no es producida por células de mamíferos y es impermeable a las membranas celulares de los mamíferos. Por lo tanto, las técnicas moleculares eficaces de la entrega, tales como sonoporation, son necesarias para alcanzar los suficientes niveles intracelulares de la trehalosa requeridos para proteger las membranas celulares internas. Este enfoque está actualmente en desarrollo para la preservación seca de varios tipos de células.
Este protocolo proporciona una descripción detallada del montaje y funcionamiento de un sistema acoustofluidic de costo relativamente bajo impulsado por un microcontrolador. Los agentes del contraste del ultrasonido se utilizan para inducir el sonoporation dentro de los canales fluídicos y para permitir entrega molecular rápida a los varios tipos de la célula, incluyendo las células de T y las células cancerosas. Este sistema acoustofluidic se puede utilizar para una variedad de aplicaciones de la investigación y puede también ser útil como sistema del prototipo para evaluar métodos de la sonoporación para los procesos de fabricación mejorados de la terapia celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el montaje y el funcionamiento de un sistema acoustofluidic de bajo costo que mejora la entrega intracelular de biomoléculas para aplicaciones de investigación. Hay varios factores importantes a tener en cuenta al ensamblar y operar este sistema. El dispositivo acoustofluidic se fabrica en PDMS, que es un material biocompatible que se puede moldear fácilmente con dimensiones de canalconsistentes 27. Los canales del dispositivo se pueden enjuagar con 15 mL de solución de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) y los Institutos Nacionales de Salud (U01HL127518). Los servicios de fotolitografía fueron proporcionados por el Centro de Tecnología Micro/Nano de la Universidad de Louisville.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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