Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células
Summary
Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um dispositivo acoustofluido de baixo custo para rápida entrega molecular às células através de sonoporação induzida por agentes de contraste de ultrassom.
Abstract
A entrega intracelular eficiente de biomoléculas é necessária para uma ampla gama de pesquisas biomédicas e aplicações terapêuticas baseadas em células. Sonoporação mediada por ultrassom é uma técnica emergente para rápida entrega intracelular de biomoléculas. A sonoporação ocorre quando a cavitação de microbolhas cheias de gás forma poros transitórios em membranas celulares próximas, o que permite a absorção rápida de biomoléculas do fluido circundante. As técnicas atuais de sonoporção in vitro de células em suspensão são limitadas pelo rendimento lento, variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom para cada célula e alto custo. Para lidar com essas limitações, foi desenvolvido um dispositivo acoustofluido de baixo custo que integra um transdutor de ultrassom em um dispositivo fluido baseado em PDMS para induzir a sonoporação consistente das células à medida que elas fluem pelos canais em combinação com agentes de contraste de ultrassom. O dispositivo é fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão para produzir o chip fluido baseado em PDMS. Um transdutor de disco de ultrassom piezo é anexado ao dispositivo e conduzido por um microcontrolador. O conjunto pode ser integrado dentro de uma caixa impressa em 3D para proteção adicional. As células e microbolhas são empurradas através do dispositivo usando uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica conectada à tubulação de PVC. A entrega aprimorada de biomoléculas para células T humanas e células cancerígenas de pulmão é demonstrada com este sistema acoustofluido. Em comparação com as abordagens de tratamento em massa, este sistema acoustofluidic aumenta o rendimento e reduz a variabilidade, o que pode melhorar os métodos de processamento celular para aplicações de pesquisa biomédica e fabricação de terapêuticas baseadas em células.
Introduction
Plataformas virais e não virais têm sido utilizadas para melhorar a entrega molecular às células. A entrega viral (transdução) é uma técnica comum utilizada em terapias baseadas em células que requerem modificação genômica. As limitações com a entrega viral incluem mutagênese insercional potencial, capacidade transgênica limitada e multiplicidade indesejada de infecção1,2. Portanto, técnicas de entrega molecular não viral estão em desenvolvimento para uma ampla gama de aplicações biomédicas e de pesquisa. Técnicas comuns incluem mecânica, elétrica, hidrodinâmica ou o uso de energia baseada a laser para melhorar a absorção de biomoléculas nas células 3. A eletroporação é uma plataforma de entrega molecular não viral comumente utilizada que tem a capacidade de induzir perfuração transitória na membrana plasmática para a entrega intracelular dos compostos moleculares4,5,6,7,8,9. No entanto, a perfuração transitória da membrana plasmática é um processo estocástico e a absorção molecular via eletroporação é geralmente dependente da difusão passiva através dos poros da membrana transitória4,7,8.
Um método alternativo é a utilização de ultrassom para melhor entrega molecular intracelular através da cavitação de agentes de contraste de ultrassom (ou seja, microbolhas cheias de gás). A cavitação de microbolhas induz efeitos de microstreaming na mídia circundante que podem causar perfuração transitória de membranas plasmáticas próximas (“sonoporação”) permitindo a rápida absorção intracelular de biomoléculas através de mecanismos de transporte passivos ou ativos10,11,12. A sonoporação é uma técnica eficaz para a rápida entrega molecular às células, mas essa abordagem muitas vezes requer equipamentos caros e métodos de tratamento em massa que são limitados por menor rendimento e maior variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom13. Para lidar com essas limitações, os dispositivos aoustofluidos, que permitem a sonoporação consistente das células em suspensão, estão atualmente em desenvolvimento.
Acoustofluidics é um campo em expansão que integra tecnologias de ultrassom e microfluidic para uma ampla variedade de aplicações. Esta abordagem tem sido usada anteriormente para a separação de partículas, aplicando energia contínua de ultrassom para induzir ondas acústicas permanentes dentro dos canais fluidos14,15,16,17. As partículas são classificadas em diferentes partes do dispositivo com base em uma variedade de propriedades, como tamanho de partícula, densidade e compressão em relação ao médio16. Tecnologias acoustofluídicas também estão em desenvolvimento para permitir a entrega molecular rápida a uma variedade de tipos de células para aplicações de pesquisa e fabricação de terapias celulares18. Recentemente, demonstramos uma entrega molecular aprimorada para eritrócitos usando um dispositivo acoustofluido baseado em PDMS19. Na plataforma acoustofluidic, a dinâmica celular e microbolhas pode ser manipulada para induzir interações físicas que permitem uma entrega aprimorada de biomoléculas. A eficiência e consistência da entrega molecular intracelular pode potencialmente ser aumentada otimizando a distância entre células e microbolhas.
Uma aplicação importante para a sonoporação mediada por aoustofluidic envolve o transporte de biomoléculas para células T humanas primárias. Imunoterápicos baseados na transferência de células T adotivas, como a terapia de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR T), estão surgindo rapidamente para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer e vírus como o HIV20. A terapia CAR T tem sido particularmente eficaz em pacientes com leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA), com taxas de remissão completas de 70-90%21. No entanto, a fabricação de células T para essas terapias geralmente depende da transdução viral, que é limitada por mutagênese insercional potencial, longos tempos de processamento e desafios de fornecer biomoléculas não genéticas, como proteínas ou pequenas moléculas1. Métodos de entrega molecular mediados por acoustofluidic podem potencialmente superar essas limitações e melhorar a fabricação de terapias celulares T.
Outra aplicação importante para a sonoporação mediada por austofluidic envolve a entrega intracelular de compostos conservantes, como o trehalose, que protegem as células durante o congelamento e a dessecação. O trehalose é produzido por alguns organismos na natureza e os ajuda a tolerar congelamento e dessacação protegendo suas membranas celulares22,23. No entanto, o trehalose não é produzido por células mamíferas e é impermeável às membranas celulares de mamíferos. Portanto, técnicas eficazes de entrega molecular, como a sonoporação, são necessárias para alcançar níveis suficientes de trehalose intracelular necessários para proteger membranas celulares internas. Esta abordagem está atualmente em desenvolvimento para preservação seca de vários tipos de células.
Este protocolo fornece uma descrição detalhada da montagem e operação de um sistema aoustofluido relativamente de baixo custo conduzido por um microcontrolador. Os agentes de contraste do ultrassom são utilizados para induzir a sonoporação dentro dos canais fluidos e permitir a entrega molecular rápida para vários tipos de células, incluindo células T e células cancerosas. Este sistema acoustofluidic pode ser usado para uma variedade de aplicações de pesquisa e também pode ser útil como um sistema protótipo para avaliar métodos de sonoporação para melhores processos de fabricação de terapia celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido de baixo custo que melhora a entrega intracelular de biomoléculas para aplicações de pesquisa. Existem vários fatores importantes a serem considerados na montagem e operação deste sistema. O dispositivo acoustofluido é fabricado em PDMS, que é um material biocompatível que pode ser facilmente moldado com dimensões de canal consistentes27. Os canais do dispositivo podem ser enxaguados com 15 mL de solução d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado, em parte, por meio de financiamento da Fundação Nacional de Ciência (#1827521, #1827521, #1450370) e dos Institutos Nacionais de Saúde (U01HL127518). Os serviços de fotolitografia foram prestados pelo Centro de Tecnologia Micro/Nano da Universidade de Louisville.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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