Een stapsgewijze handleiding voor muggenelektroantennografie
Summary
Het huidige artikel beschrijft een stap-voor-stap protocol voor succesvolle en geluidsarme elektroantennogrammen in verschillende geslachten van muggen, waaronder zowel vrouwtjes als mannetjes.
Abstract
Vrouwelijke muggen zijn de dodelijkste dieren op aarde en eisen elk jaar het leven van meer dan 1 miljoen mensen als gevolg van ziekteverwekkers die ze overbrengen bij het verkrijgen van een bloedmaaltijd. Om een gastheer te vinden om zich mee te voeden, vertrouwen muggen op een breed scala aan sensorische signalen, waaronder visuele, mechanische, thermische en olfactorische. De studie beschrijft een techniek, elektroantennografie (EAG), waarmee onderzoekers kunnen beoordelen of de muggen individuele chemicaliën en mengsels van chemicaliën op een concentratieafhankelijke manier kunnen detecteren. In combinatie met gaschromatografie (GC-EAG) maakt deze techniek het mogelijk om de antennes bloot te stellen aan een volledige headspace / complex mengsel en bepaalt welke chemicaliën aanwezig zijn in het monster van belang dat de mug kan detecteren. Dit is van toepassing op geuren van het gastheerlichaam, maar ook op bloemboeketten van planten of andere ecologisch relevante geuren (bijv. Geurstoffen van ovipositiesites). Hier hebben we een protocol beschreven dat een lange duur van de reactietijd van de voorbereiding mogelijk maakt en van toepassing is op zowel vrouwelijke als mannelijke muggen uit meerdere geslachten, waaronder Aedes, Culex, Anopheles en Toxorhynchites-muggen . Omdat reukzin een belangrijke rol speelt in interacties tussen muggen en gastheer en muggenbiologie in het algemeen, kunnen EAG’s en GC-EAG verbindingen onthullen die van belang zijn voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de bestrijding van ziektevectoren (bijv. Aas ). Aangevuld met gedragstests kan de valentie (bijv. Lokstof, afweermiddel) van elke chemische stof worden bepaald.
Introduction
Muggen zijn de dodelijkste organismen op aarde, eisen het leven van meer dan een miljoen mensen per jaar en brengen meer dan de helft van de wereldbevolking in gevaar voor blootstelling aan de ziekteverwekkers die ze overbrengen, terwijl zebijten 1. Deze insecten vertrouwen op een breed scala aan signalen (d.w.z. thermisch, visueel, mechanisch, olfactorisch, auditief) om een gastheer te vinden om zich mee te voeden (zowel plant als dier), voor paring en ovipositie, en om roofdieren te vermijden in zowel de larvale als volwassen stadia 2,3. Onder deze zintuigen speelt reukzin een cruciale rol in de bovengenoemde gedragingen, met name voor detectie op middellange tot lange afstand van geurmoleculen 2,3. Geuren die worden uitgezonden door een gastheer of een ovipositieplaats worden gedetecteerd door verschillende specifieke reukreceptoren (bijv. GRs, OK’s, IR’s) op de muggenpalpen proboscis, tarsi en antennes 2,3.
Omdat reukzin een belangrijk onderdeel is van hun gastheerzoekende (plant en dier), parings- en ovipositiegedrag, vormt het dus een ideaal doelwit om te bestuderen om nieuwe hulpmiddelen voor muggenbestrijdingte ontwikkelen 4. Onderzoek naar insectenwerende middelen (bijv. DEET, IR3535, picaridin) en aas (bijv. BG sentinel menselijk kunstaas) is uiterst productief5, maar vanwege de huidige uitdagingen in muggenbestrijding (bijv. Insecticideresistentie, invasieve soorten), is het essentieel om nieuwe efficiënte bestrijdingsmethoden te ontwikkelen op basis van de muggenbiologie.
Veel technieken (bijv. olfactometer, landingstests, elektrofysiologie) zijn gebruikt om de bioactiviteit van verbindingen of mengsels van verbindingen in muggen te beoordelen. Onder hen kan elektroantennografie (of elektroantennogrammen (EAG’s)) worden gebruikt om te bepalen of de geurstoffen worden gedetecteerd door de muggenantennes. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld door Schneider6 en is sindsdien in veel verschillende insectengeslachten gebruikt, waaronder motten 7,8,9, hommels 10,11, honingbijen 12,13 en fruitvliegen 14,15 om er maar een paar te noemen. Elektroantennografie is ook gebruikt met behulp van verschillende protocollen, waaronder enkele of meerdere antennes bij muggen 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Muggen zijn relatief kleine en delicate insecten met vrij dunne antennes. Hoewel het uitvoeren van EAG’s op grotere insecten zoals motten of hommels relatief eenvoudig is vanwege hun grotere formaat en dikkere antennes, kan het uitvoeren van EAG’s bij muggen een uitdaging zijn. Met name het handhaven van een goede signaal-ruisverhouding en een duurzame responsieve voorbereiding zijn twee belangrijke vereisten voor de reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van gegevens.
De stapsgewijze handleiding voor geluidsarme EAG’s die hier wordt voorgesteld, biedt direct oplossingen voor deze beperkingen en maakt dit protocol van toepassing op verschillende muggensoorten uit verschillende geslachten, waaronder Aedes, Anopheles, Culex en Toxorhynchites, en beschrijft de techniek voor zowel vrouwtjes als mannetjes. Elektroantennografie biedt een snelle maar betrouwbare manier om bioactieve stoffen te screenen en te bepalen die vervolgens kunnen worden gebruikt bij de ontwikkeling van aas nadat de valentie is bepaald met gedragstests.
Protocol
Representative Results
Discussion
Olfactorisch gemedieerd gedrag wordt beïnvloed door vele factoren, waaronder fysiologisch (bijv. Leeftijd, tijdstip van de dag) en omgeving (bijv. Temperatuur, relatieve vochtigheid)30. Bij het uitvoeren van EAG’s is het dus essentieel om insecten te gebruiken die zich in dezelfde fysiologische status bevinden (d.w.z. monitoring op leeftijd, verhongering, paring)31 en om ook een warme en vochtige omgeving rond het preparaat te behouden om uitdroging te voorkomen. Een tempe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik ben Dr. Clément Vinauger en Dr. Jeffrey Riffell dankbaar voor de nuttige discussies. De volgende reagentia werden verkregen via BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, bijgedragen door Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, bijgedragen door David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Stam JHB, Eieren, NR-43025. De auteur bedankt Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger en Jeffrey Marano voor het verstrekken van Culex quinquefasciatus en Anopheles stephensi (stam: Liston) muggeneieren. Aedes albopictus en Toxorhynchites rutilus septentrionalis zijn afgeleid van veldmuggen verzameld door de auteur in het New River Valley-gebied (VA, VS). Dit werk werd ondersteund door de afdeling Biochemie en het Fralin Life Science Institute.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
Riferimenti
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W. Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 645-652 (2004).
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito’s sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. . The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
