Sivrisinek elektroantennografisi için adım adım kılavuz
Summary
Bu makale, hem dişiler hem de erkekler de dahil olmak üzere çeşitli sivrisinek cinslerinde başarılı ve düşük gürültülü elektroantennogramlar için adım adım bir protokolü detaylandırmaktadır.
Abstract
Dişi sivrisinekler dünyadaki en ölümcül hayvanlardır ve bir kan unu alırken ilettikleri patojenler nedeniyle her yıl 1 milyondan fazla insanın hayatını iddia etmektedir. Beslenecek bir konakçı bulmak için, sivrisinekler görsel, mekanik, termal ve koku alma dahil olmak üzere çok çeşitli duyusal ipuçlarına güvenirler. Çalışma, araştırmacıların sivrisineklerin bireysel kimyasalları ve kimyasalların karışımlarını konsantrasyona bağlı bir şekilde tespit edip edemeyeceğini değerlendirmelerini sağlayan bir teknik olan elektroantennografiyi (EAG) detaylandırıyor. Gaz kromatografisi (GC-EAG) ile birleştiğinde, bu teknik antenleri tam bir kafa boşluğu / karmaşık karışıma maruz bırakmaya izin verir ve ilgili numunede hangi kimyasalların bulunduğunu sivrisineklerin tespit edebileceğini belirler. Bu, konakçı vücut kokularının yanı sıra bitki çiçek buketleri veya diğer ekolojik olarak ilgili kokular (örneğin, yumurtlama bölgeleri koku vericileri) için de geçerlidir. Burada, uzun süreli hazırlık duyarlılığı süresine izin veren ve Aedes, Culex, Anopheles ve Toxorhynchites sivrisinekleri de dahil olmak üzere birden fazla cinsten hem dişi hem de erkek sivrisineklere uygulanabilir bir protokol tanımladık. Koku alma, sivrisinek-konakçı etkileşimlerinde ve genel olarak sivrisinek biyolojisinde önemli bir rol oynadığından, EAG’ler ve GC-EAG, yeni hastalık vektör kontrol stratejilerinin (örneğin, yemler) geliştirilmesi için ilgi çekici bileşikleri ortaya çıkarabilir. Davranışsal analizlerle tamamlandığında, her kimyasalın değeri (örneğin, çekici, kovucu) belirlenebilir.
Introduction
Sivrisinekler, dünyadaki en ölümcül organizmalardır, yılda bir milyondan fazla insanın hayatını iddia eder ve dünya nüfusunun yarısından fazlasını,1’i ısırırken, ilettikleri patojenlere maruz kalma riskine sokarlar. Bu böcekler, beslenecek bir konakçı (hem bitki hem de hayvan) bulmak, çiftleşmek ve yumurtlamak ve hem larva hem de yetişkin aşamalarında avcılardan kaçınmak için çok çeşitli ipuçlarına (yani termal, görsel, mekanik, koku alma, işitsel) güvenir 2,3. Bu duyular arasında, koku alma yukarıda belirtilen davranışlarda, özellikle koku verici moleküllerin orta ila uzun menzilli tespiti için kritik bir rol oynar 2,3. Bir konakçı veya bir yumurtlama bölgesi tarafından yayılan kokular, sivrisinek palps hortumu, tarsi ve anten2,3 üzerinde bulunan çeşitli spesifik koku alma reseptörleri (örneğin, GR’ler, OR’lar, IR’ler) tarafından tespit edilir.
Koku alma, konakçı arama (bitki ve hayvan), çiftleşme ve yumurtlama davranışlarının önemli bir bileşeni olduğundan, sivrisinek kontrolü için yeni araçlar geliştirmek üzere çalışmak için ideal bir hedef oluşturur4. Kovucular (örneğin, DEET, IR3535, picaridin) ve yemler (örneğin, BG sentinel insan cazibesi) üzerine yapılan araştırmalar son derece üretkendir5, ancak sivrisinek kontrolündeki mevcut zorluklar nedeniyle (örneğin, böcek ilacı direnci, istilacı türler), sivrisinek biyolojisi tarafından bilgilendirilen yeni etkili kontrol yöntemleri geliştirmek esastır.
Sivrisineklerdeki bileşiklerin veya bileşik karışımlarının biyoaktivitesini değerlendirmek için birçok teknik (örneğin, olfaktometre, iniş tahlilleri, elektrofizyoloji) kullanılmıştır. Bunlar arasında, koku vericilerin sivrisinek antenleri tarafından tespit edilip edilmediğini belirlemek için elektroantennografi (veya elektroantennogramlar (EAG’ler)) kullanılabilir. Bu teknik başlangıçta Schneider6 tarafından geliştirilmiştir ve o zamandan beri güveler 7,8,9, bombus arıları 10,11, bal arıları 12,13 ve meyve sinekleri14,15 dahil olmak üzere birçok farklı böcek cinsinde kullanılmıştır. Elektroantennografi ayrıca sivrisineklerde tek veya çoklu antenler de dahil olmak üzere çeşitli protokoller kullanılarak kullanılmıştır 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Sivrisinekler oldukça ince antenli nispeten küçük ve hassas böceklerdir. EAG’leri güveler veya bombus arıları gibi daha büyük böcekler üzerinde gerçekleştirmek, daha büyük boyutları ve daha kalın antenleri nedeniyle nispeten kolay olsa da, sivrisineklerde EAG’lerin iletilmesi zor olabilir. Özellikle, iyi bir sinyal-gürültü oranının korunması ve kalıcı bir yanıt hazırlığı, verilerin tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği için iki ana gereksinimdir.
Burada önerilen düşük gürültülü EAG’ler için adım adım kılavuz, doğrudan bu sınırlamalara çözümler sunar ve bu protokolü Aedes, Anopheles, Culex ve Toxorhynchites dahil olmak üzere çeşitli cinslerden çeşitli sivrisinek türlerine uygulanabilir hale getirir ve hem dişiler hem de erkekler için tekniği açıklar. Elektroantennografi, davranışsal testlerle değerlik belirlendikten sonra yem gelişiminde kullanılabilecek biyoaktif bileşikleri taramak ve belirlemek için hızlı ama güvenilir bir yol sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koku alma aracılı davranışlar, fizyolojik (örneğin, yaş, günün saati) ve çevresel (örneğin, sıcaklık, bağıl nem) dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenir30. Bu nedenle, EAG’leri yürütürken, aynı fizyolojik durumda olan böceklerin kullanılması (yani, yaşın izlenmesi, açlık, çiftleşme)31 ve ayrıca kurumayı önlemek için preparatın etrafında sıcak ve nemli bir ortam sağlamak esastır. 25 °C civarında bir sıcaklık idealdir ve ana h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Clément Vinauger ve Dr. Jeffrey Riffell’e yararlı tartışmalar için minnettarım. Aşağıdaki reaktifler BEI Resources, NIAID, NIH aracılığıyla elde edilmiştir: Mark Q. Benedict’in katkıda bulunduğu Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, David W. Severson’ın katkılarıyla; Culex quinquefasciatus, Suş JHB, Yumurtalar, NR-43025. Yazar, Culex quinquefasciatus ve Anopheles stephensi (suş: Liston) sivrisinek yumurtaları sağladıkları için Dr. Jake Tu, Dr. Nisha Duggal, Dr. James Weger ve Jeffrey Marano’ya teşekkür eder. Aedes albopictus ve Toxorhynchites rutilus septentrionalis , yazar tarafından New River Valley bölgesinde (VA, ABD) toplanan tarla sivrisineklerinden türetilmiştir. Bu çalışma Biyokimya Bölümü ve Fralin Yaşam Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Air table Clean Bench | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Noise reducer |
| Analog-to-digital board | National Instruments | BNC-2090A | |
| Benchtop Flowbuddy Complete | Genesee Scientific | 59-122BC | To anesthesize mosquitoes |
| Borosillicate glass capillary | Sutter Instrument | B100-78-10 | To make the recording and references capillaries |
| Chemicals | Sigma Aldrich | Benzaldehyde: 418099-100 mL; Butyric acid: B103500-100mL; 1-Hexanol: 471402-100mL; Mineral oil: M8410-1L | Chemicals used for the experiments presented here |
| CO2 | Airgas or Praxair | N/A | To anesthesize mosquitoes |
| Cold Light Source | Volpi | NCL-150 | |
| Disposable syringes | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657) | |
| Electrode cables | World Precision Instruments | 5371 | |
| Electrode gel salt free | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Faraday cage | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Noise reducer |
| Flowmeters | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | One of each |
| GCMS vials and caps | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | To prepare odorant dilutions |
| Glass syringes (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | For odor delivery to the EAG prep |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Noise reducer |
| 2 mm Jack Holder, Narrow, 90 deg., With Wire | A-M Systems | 675748 | Electrode holder |
| Magnetic bases | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | For delivering the pulses |
| Medical air | Airgas or Praxair | N/A | For main airline |
| Microscope | Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipulators Three-Axis Coarse/Fine Compact Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Microelectrode amplifier with headstage | A-M Systems | Model 1800 | |
| Mosquito rearing supplies | Bioquip | https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp | |
| Needles | BD | 25G (305127) / 21G (305165) | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | For odor delivery to the EAG prep |
| PTFE Tubing of different diameters | Mc Master Carr | N/A | To connect solenoid valve, flowmeter, airline ect. |
| 30V/5A DC Power Supply | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R version 3.5.1 | R project | https://www.r-project.org/ | For data analyses |
| Relay for solenoid valve | N/A | Custom made | |
| Silver wire 0.01” | A-M Systems | 782500 | |
| Solenoid valve (3-way) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| WinEDR software | Strathclyde Electrophysiology Software | WinEDR V3.9.1 | For EAG recording |
| Whatman paper | Cole Parmer | UX-06648-03 | To load chemical in glass syringe / Pasteur pipette |
Riferimenti
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
- Zwiebel, L. J., Takken, W. Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 645-652 (2004).
- Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito’s sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
- Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
- Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
- Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
- Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
- Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
- Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
- Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
- De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
- Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
- Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
- Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
- Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
- Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
- Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
- Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
- Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
- Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
- Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183 (2011).
- Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
- Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017 (2019).
- Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
- Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
- Oesterle, A. . The Pipette Cookbook. , (2018).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2018).
- Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
- Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
- Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
- Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
- Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147 (2018).
- Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
- Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).
