Induksjon av mikrostreaming ved ikke-sfæriske bobleoscillasjoner i et akustisk levitasjonssystem

Summary

En rask og pålitelig teknikk foreslås for å kontrollere formsvingningene til en enkelt, fanget akustisk boble som er basert på koalescensteknikk mellom to bobler. De steady-state, symmetristyrte bobleformoscillasjonene tillater analyse av væskestrømmen som genereres i nærheten av boblegrensesnittet.

Abstract

Når de ligger nær biologiske barrierer, kan oscillerende mikrobobler øke cellemembranpermeabiliteten, noe som muliggjør internalisering av legemidler og gener. Eksperimentelle observasjoner tyder på at den midlertidige permeabiliseringen av disse barrierene kan skyldes skjærspenning som utøves på cellevev ved kavitasjonsmikrostreaming. Kavitasjonsmikrostreaming er genereringen av virvelstrømmer som oppstår rundt oscillerende ultralydmikrobobler. For å produsere slike væskestrømmer må bobleoscillasjoner avvike fra rent sfæriske svingninger og inkludere enten translasjonsstabilitet eller formmodus. Eksperimentelle studier av bobleinduserte strømmer og skjærspenning på nærliggende overflater er ofte begrenset i omfang på grunn av vanskeligheten med å fange formdeformasjoner av mikrobobler på en stabil og kontrollerbar måte. Vi beskriver utformingen av et akustisk levitasjonskammer for studier av symmetrikontrollerte ikke-sfæriske svingninger. Slik kontroll utføres ved å bruke en koalescensteknikk mellom to nærliggende bobler i et tilstrekkelig intenst ultralydfelt. Kontrollen av ikke-sfæriske svingninger åpner veien for en kontrollert kavitasjon mikrostreaming av en fri overflate-oscillerende mikroboble. Kameraer med høy bildefrekvens gjør det mulig å undersøke kvasi-samtidig den ikke-sfæriske bobledynamikken ved den akustiske tidsskalaen og væskestrømmen på en lavere tidsskala. Det er vist at et stort utvalg av væskemønstre kan oppnås, og at de er korrelert med det modale innholdet i boblegrensesnittet. Vi demonstrerer at selv høyordensformmodusene kan skape væskemønstre over store avstander hvis grensesnittdynamikken inneholder flere moduser, noe som fremhever potensialet for ikke-sfæriske svingninger for målrettet og lokalisert legemiddellevering.

Introduction

I medisin må et administrert legemiddel trenge gjennom mange hindringer i levesystemet før de når de ønskede målene. Imidlertid blir de fleste medisiner raskt renset bort fra blodstrømmen. Målrettingseffektiviteten er lav, og de kan ikke lett krysse cellemembraner, noe som fører til ineffektiv legemiddellevering. For tiden har bruk av mikrobobler i kombinasjon med ultralyd blitt foreslått som en innovativ metode for ikke-invasiv, presis og målrettet levering av medisiner og gener til patologiske vev og celler¹. I denne tilnærmingen kan mikrobobler spille en rolle som bærere der gratis legemidler enten injiseres samtidig med en gassboblesuspensjon eller lastes på overflaten. Mikrobobler kan også fungere som en lokal vektor for å refokusere ultralydenergien for å interagere med cellene. I utgangspunktet, under ultralydeksponering, komprimerer og utvider bobler stabilt, et regime som kalles stabil kavitasjon som genererer væskestrømmer og dermed skjærspenning på nærliggende gjenstander. Mikrobobler kan også svinge ikke-lineært og ekspandere til kollaps, i treghetskavitasjonsregimet, og produsere sjokkbølger som forplanter seg radialt fra kollapsstedet². Det har vist seg at kavitasjon, enten stabil eller treghet, forbedrer permeabiliseringen av cellemembraner, og forbedrer dermed internaliseringen av legemidler i cellen³.

I terapeutiske anvendelser er det svært viktig å forstå mekanismen for boble-celle-interaksjonen, men det er flere barrierer, både fra vitenskapelige og tekniske sider, som hindrer vår kunnskap i å utvikle seg. For det første er det svært vanskelig å fange dynamikken til celler som respons på bobleinduserte mekaniske stimuli⁴. På den akustiske tidsskalaen kan førsteordens mikrobobleoscillasjoner føre til aktivering av membrankanaler, noe som letter molekylær passasje over biologiske grensesnitt. Dette skjer gjennom direkte svingning av cellemembranen, også kalt “cellulær massasje”⁵. Kanalaktivering etter direkte mekanisk belastning ble påvist ved hjelp av patch-clamp-teknikker som målte elektrofysiologiske egenskaper til cellemembraner under og etter ultralydeksponering⁶. Måling av bobleindusert celledynamikk (som betyr hele feltet for deformasjon av cellemembranen) på den akustiske tidsskalaen, vil også gi innsikt i terskelen for membranområdeutvidelse ΔA / A som kreves for å indusere porene i cellemembranen⁷. Den andre barrieren er å kontrollere det kollapsende bobleregimet for å unngå mikrobobleindusert cellelyse. Boblekollapser og induserte mikrostråler har blitt identifisert som en mekanisme gjennom hvilken membranperforering skjer ^8,9. Når den er permeabilisert, reparerer cellemembranen gjennom kalsiumselvforsegling av lipid-dobbeltlagene og fusjon av intracellulære vesikler⁹. Forekomsten av boblekollapser kan også forårsake dødelige skader på cellen og indusere unødvendige bivirkninger i de omkringliggende. I sensitive applikasjoner som ultralydmediert blod-hjernebarriereåpning er det generelt akseptert at treghetsboblekollapser bør unngås¹⁰.

Derfor er det for tiden lagt stor vekt på utformingen av ultralydutslippssekvenser, kombinert med passiv kavitasjonsovervåking og kontroll, for å sikre stabile svingninger av mikrobobler¹¹. I dette stabile regimet har det blitt antatt at stabilt oscillerende bobler spiller en sterk rolle i utløsningen av membranpermeabilisering ved å fremme romlig målrettet skjærspenning på cellemembranen⁷. Skjærspenningen skyldes væskestrømmene som oppstår i nærheten av de oscillerende boblene. Disse væskestrømmene kalles kavitasjonsmikrostreaming, og som nevnt ovenfor er de en av flere mulige mekanismer som er ansvarlige for økt opptak av ekstracellulære molekyler. Når det gjelder suspensjon av bobler eller celler som in vitro biologiske transfeksjonsanalyser¹², kan permeabilisering ved mikrostreaming være mye mer effektiv enn permeabilisering ved boblekollaps. Dette kan vises ved en enkel geometrisk vurdering. I cellesuspensjoner vil sonoporasjon være effektiv hvis flertallet av de suspenderte cellene blir utsatt for tilstrekkelig store mekaniske effekter (som fører til membranpermeabilisering). Det er kjent at boblekollapser er rettet langs retningen av isotrop symmetribrudd, for eksempel bobleveggaksen¹³ eller bobleboble- og boblecellelinjen som forbinder deres massesenter¹⁴. Den produserte mikrostrålen er derfor et romlig lokalisert fenomen langs et endelig antall linjer som forbinder celle- og boblesentrene. Avhengig av celle- og boblekonsentrasjonen, så vel som boblecelleavstanden, kan denne effekten ikke være den mest effektive for å permeabilisere hele antall suspenderte celler. I motsetning til dette er kavitasjonsmikrostreaming et fenomen som forekommer på en langsom tidsskala, med en stor romlig ekspansjon i forhold til bobleradiusen. Væskestrømmen fordeles også rundt boblen, og kan derfor påvirke et større antall celler, på svært lang avstand. Derfor er forståelse av den genererte kavitasjonsmikrostrømmen rundt en oscillerende boble en forutsetning for å kontrollere og kvantifisere det bobleinduserte skjærspenningen som påføres celler.

For å gjøre dette består et foreløpig trinn i å kontrollere de sfæriske og ikke-sfæriske svingningene til en ultralyddrevet boble, da de genererte væskestrømmene induseres av bevegelsen til boblegrensesnittet^15,16. Spesielt må formsvingninger av mikrobobler utløses og holdes stabile. Videre må orienteringen av bobleformoscillasjonene kontrolleres for å analysere korrelasjonen mellom boblegrensesnittdynamikken og det induserte mikrostreamingmønsteret riktig. Når man oppsummerer eksisterende litteratur, er det åpenbart at detaljerte eksperimentelle resultater av kavitasjonsindusert mikrostreaming bare er tilgjengelige for bobler festet til en overflate. Veggfestede mikrobobler brukes ofte til å vurdere nøyaktig grensesnittdynamikk og celleinteraksjoner på mikrometerskala under et ultrafast mikroskopisystem. Denne konfigurasjonen er terapeutisk relevant når man vurderer vibrerende mikrobobler plassert på cellemembranen^17,18,19. Studien av substratfestet boble kan imidlertid gjøre analysen av bobledynamikk mer komplisert, delvis på grunn av den komplekse naturen til kontaktlinjedynamikk²⁰, og utløsningen av asymmetriske formmodi²¹. I medisinske og biologiske applikasjoner, bobler som ikke er festet til en vegg er ofte funnet i begrensede geometrier som små fartøy. Dette påvirker bobledynamikken og formustabiliteten betydelig. Spesielt forskyver tilstedeværelsen av en nærliggende vegg trykkterskelen for formmodus som utløser lavere trykkverdier avhengig av formmodusnummer og boblestørrelse²². Veggen påvirker også den bobleinduserte mikrostrømmen med muligens høyere intensitet for den produserte strømmen²³.

Blant alle mulige scenarier som mikrobobler kan oppleve (fri eller festet, nær en vegg, kollapser eller stabilt oscillerende), foreslår vi å undersøke den ikke-sfæriske dynamikken til en enkelt boble langt fra noen grense. Det eksperimentelle oppsettet er basert på et akustisk levitasjonssystem²⁴ der en stående ultralydbølge brukes til å fange boblen. Dette scenariet er konsistent med medisinske applikasjoner der en samling av suspenderte bobler og celler sameksisterer i et sonotransfeksjonskammer, for eksempel. Så langt som bobler og celler ikke er for nært, antas det at tilstedeværelsen av en celle ikke påvirker boblegrensesnittdynamikken. Når celler følger de sløyfelignende banene til den kavitasjonsinduserte mikrostrømmen, nærmer de seg syklisk og frastøter seg fra bobleplasseringen, og vi kan anta at celletilstedeværelsen verken påvirker strømningsmønsteret eller dets gjennomsnittlige hastighet. I tillegg er ikke-sfærisk dynamikk og indusert mikrostreaming fra enkeltbobler langt fra grense velkjent fra et teoretisk synspunkt. For å koble den bobleinduserte væskestrømmen til boblekonturdynamikken, er det nødvendig å nøyaktig karakterisere boblegrensesnittdynamikken. For å gjøre dette er det å foretrekke å tilpasse den spatiotemporale skalaen i eksperimentelle studier med hensyn til de som brukes i terapeutikk, slik at oppkjøp med vanlige høyhastighetskameraer (under 1 million bilder / sekund) er mulig ved å bruke store bobler eksitert ved lavere frekvenser. Når man vurderer ubelagte bobler, er egenfrekvensen ω n for en gitt modus _n relatert til boblestørrelsen som ²⁵. Dette radius-egenfrekvensforholdet er litt modifisert når man vurderer avskallede bobler²⁶, men størrelsesordenen til egenfrekvensen ω_n forblir den samme. Dermed er undersøkelse av bobler med likevektsradier ~ 50μm i et 30 kHz ultralydfelt lik å studere belagte bobler av radier ~ 3μm i et 1.7 MHz-felt, som foreslått av Dollet et ^al.27. Lignende formmodusnumre og dermed mikrostreamingmønstre forventes derfor.

For å utløse ikke-sfæriske svingninger i boblegrensesnittet, er det nødvendig å overskride en viss trykkterskel som er radiusavhengig, som vist i figur 1. Eksisterende eksperimentelle teknikker er avhengige av økningen av det akustiske trykket for å utløse overflatemoduser (illustrert ved bane (1) i figur 1), enten ved trinnvis trykkøkning²⁸ eller ved modulert amplitudeeksitasjon som er ansvarlig for periodisk utbrudd og utryddelse av overflatemodus²⁹. De viktigste ulempene med disse teknikkene er (i) en tilfeldig orientering av symmetriaksen til overflatesvingningene som ikke kan kontrolleres for å være i avbildningsplanet, (ii) en kort levetid for bobleformsvingningene som gjør analysen av de induserte væskestrømmene vanskelig ved større tidsskalaer, og (iii) den hyppige utløsningen av ustabile formmoduser. Vi foreslår en alternativ teknikk for å krysse trykkterskelen ved et konstant akustisk trykk i radius/trykkkartet, som illustrert ved banen (2) i figur 1. For å gjøre det, er det nødvendig å øke boblestørrelsen slik at den vil være i ustabilitetssonen. En slik økning utføres ved en boblekoalescensteknikk. Koalescensen av to, i utgangspunktet sfærisk oscillerende, mikrobobler utnyttes for å skape en enkelt deformert boble. Hvis det akustiske trykket og boblestørrelsen til den koalescerte boblen er i ustabilitetssonen, utløses overflatemoduser. Vi viste også at koalesensteknikken induserer stabile formsvingninger i et steady-state-regime, samt en kontrollert symmetriakse definert av rettlinjet bevegelse av de to nærliggende boblene. Fordi en stabil formsvingning sikres over minutter, er analysen av bobleindusert væskestrøm mulig ved å så væskemediet med fluorescerende mikropartikler, opplyst av et tynt laserark. Registrering av bevegelsen av de faste mikropartiklene i nærheten av boblegrensesnittet gjør det mulig å identifisere mønsteret av den induserte væskestrømmen³⁰. Det overordnede prinsippet for utløsing av bobleformsvingninger, som fører til en tidsstabil væskestrøm, er illustrert i figur 2.

I den følgende protokollen skisserer vi trinnene som kreves for å skape stabile bobleformoscillasjoner via koalesensteknikken og beskriver målingene av væskestrøm. Dette inkluderer utformingen av det akustiske levitasjonssystemet, den akustiske kalibreringen, boblekjernedannelsen og koalesensteknikken, måling av boblegrensesnittdynamikk og omgivende væskestrøm og bildebehandling.

Protocol

1. Design av det akustiske levitasjonskammeret Design en optisk gjennomsiktig (PMMA-lignende) kubikktank (8 cm kant og 2,8 mm tykkelse per ansikt) med geometrimodulen til en multifysikksimuleringsprogramvare (materialfortegnelse). Sett inn en sylindrisk overflate (Ø = 35 mm) sentrert i bunnen av tanken, for å modellere ultralydtransduseren. Sett grensebetingelsene til nulltrykk på hver vegg med en normal forskyvning av amplitude 1 μm på transduseroverflaten. B…

Representative Results

En komplett sekvens av boblekoalescens som fører til tidsstabile, symmetrikontrollerte ikke-sfæriske svingninger er presentert i figur 9. Den nærliggende fasen av to sfærisk oscillerende bobler slutter når den tynne væskefilmen mellom de to boblene brister. Det er verdt å merke seg at boblegrensesnittene i det siste stadiet før koalescensen avviker fra sfærisitet. Begge boblene forlenges på en ellipsoidal form langs banen til den rettlinjede bevegel…

Discussion

Den presenterte prosedyren består av å bruke boblekoalescens for å utløse steady-state, symmetrikontrollerte bobleformoscillasjoner, slik at studiet av den langsiktige væskestrømmen indusert av disse svingningene. Hovedutfordringen i teknikken er kontrollen av ikke-sfæriske svingninger for at en boble blir fanget, langt fra noen grenser.

De fleste av de eksisterende teknikkene som ble foreslått i litteraturen, fokuserte på substratfestede bobler ^7,16…

Materials

Aspherical lens	Thorlabs	AL4050	Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source	CNI	MLL6FN	DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens	Thorlabs	LJ1277L1-A	lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens	Thorlabs	LK1900L1	lens of focus 250 mm
Fluorescent particles	Duke Scientific	R700	Red polymer fluorescent microspheres
Function generator	Agilent	HP33120	Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera	Vision Research	Phantom v12.0	High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium	Carlo Erba	Water for analysis	Demineralized, undegassed water
Multiphysics software	Comsol	None	Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser	New Wave Research	Solo III-15	5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens	Thorlabs	N-BK7	lens of focus 125 mm
Spherical concave lens	Thorlabs	N-SF11	Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer	SinapTec	Custom-made	Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software	NIH	ImageJ	Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage	Newport	M-406	Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage	Edmund Optics	62-299	Vertical displacement stage with micrometric screw