Summary

Inducción de microstreaming por oscilaciones de burbujas no esféricas en un sistema de levitación acústica

Published: May 09, 2021
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Summary

Se propone una técnica rápida y fiable para controlar las oscilaciones de forma de una sola burbuja acústica atrapada que se basa en la técnica de coalescencia entre dos burbujas. Las oscilaciones en forma de burbuja controladas por simetría y estado estacionario permiten analizar el flujo de fluido generado en las proximidades de la interfaz de burbuja.

Abstract

Cuando se encuentran cerca de barreras biológicas, las microburbujas oscilantes pueden aumentar la permeabilidad de la membrana celular, lo que permite la internalización de fármacos y genes. Las observaciones experimentales sugieren que la permeabilización temporal de estas barreras puede deberse al esfuerzo cortante que se ejerce sobre los tejidos celulares por micrortransmisión de cavitación. La micrortransmisión de cavitación es la generación de flujos de vórtice que surgen alrededor de microburbujas de ultrasonido oscilantes. Para producir tales flujos de líquido, las oscilaciones de burbujas deben desviarse de las oscilaciones puramente esféricas e incluir una inestabilidad de traslación o modos de forma. Los estudios experimentales de flujos inducidos por burbujas y esfuerzo cortante en superficies cercanas a menudo están restringidos en su alcance debido a la dificultad de capturar las deformaciones de forma de las microburbujas de una manera estable y controlable. Describimos el diseño de una cámara de levitación acústica para el estudio de oscilaciones no esféricas controladas por simetría. Dicho control se realiza mediante el uso de una técnica de coalescencia entre dos burbujas que se aproximan en un campo de ultrasonido suficientemente intenso. El control de oscilaciones no esféricas abre el camino a una micrortransmisión de cavitación controlada de una microburbuja oscilante de superficie libre. Las cámaras de alta velocidad de cuadro permiten investigar casi simultáneamente la dinámica de burbujas no esféricas en la escala de tiempo acústica y el flujo de líquido en una escala de tiempo más baja. Se muestra que se puede obtener una gran variedad de patrones de fluidos y que están correlacionados con el contenido modal de la interfaz de burbujas. Demostramos que incluso los modos de forma de alto orden pueden crear patrones de fluidos de gran distancia si la dinámica de la interfaz contiene varios modos, destacando el potencial de las oscilaciones no esféricas para la administración de fármacos dirigida y localizada.

Introduction

En medicina, un medicamento administrado debe penetrar muchos obstáculos en el sistema vivo antes de alcanzar los objetivos deseados. Sin embargo, la mayoría de los medicamentos se limpian rápidamente del torrente sanguíneo. La eficiencia de la focalización es baja y no pueden cruzar fácilmente las membranas celulares, lo que lleva a una administración ineficaz de medicamentos. Actualmente, el uso de microburbujas en combinación con ultrasonido ha sido propuesto como un método innovador para la administración no invasiva, precisa y dirigida de fármacos y genes a tejidos y células patológicas1. En este enfoque, las microburbujas pueden desempeñar un papel como portadores donde los medicamentos libres se inyectan conjuntamente con una suspensión de burbujas de gas o se cargan en su superficie. Las microburbujas también pueden actuar como un vector local para reenfocar la energía del ultrasonido con el fin de interactuar con las células. Básicamente, bajo la exposición al ultrasonido, las burbujas se comprimen y expanden de manera estable, un régimen llamado cavitación estable que genera flujos de líquido y, por lo tanto, tensión de cizallamiento en objetos cercanos. Las microburbujas también pueden oscilar de forma no lineal y expandirse hasta el colapso, en régimen de cavitación inercial, produciendo ondas de choque que se propagan radialmente desde el sitio de colapso2. Se ha demostrado que la cavitación, ya sea estable o inercial, mejora la permeabilización de las membranas celulares y, por lo tanto, mejora la internalización de los fármacos en la célula3.

En aplicaciones terapéuticas, comprender el mecanismo de la interacción burbuja-célula es muy importante, pero existen varias barreras, tanto científicas como técnicas, que impiden que nuestro conocimiento avance. En primer lugar, capturar la dinámica de las células en respuesta a estímulos mecánicos inducidos por burbujas es muy difícil4. En la escala de tiempo acústica, las oscilaciones de microburbujas de primer orden pueden conducir a la activación de los canales de membrana, facilitando el paso molecular a través de las interfaces biológicas. Esto ocurre a través de la oscilación directa de la membrana celular, también llamada “masaje celular”5. La activación del canal después del estrés mecánico directo se evidenció utilizando técnicas de patch-clamp que midieron las propiedades electrofisiológicas de las membranas celulares durante y después de la exposición al ultrasonido6. La medición de la dinámica celular inducida por burbujas (es decir, el campo completo de deformación de la membrana celular) en la escala de tiempo acústica, también proporcionaría información sobre el umbral de expansión del área de membrana Δ A/ A requerida para inducir poros en la membrana celular7. La segunda barrera es controlar el régimen de colapso de burbujas para evitar la lisis celular inducida por microburbujas. Los colapsos de burbujas y los microchorros inducidos han sido identificados como un mecanismo a través del cual ocurre la perforación de la membrana 8,9. Una vez permeabilizada, la membrana celular se repara mediante el autosellado del calcio de las bicapas lipídicas y la fusión de vesículas intracelulares9. La aparición de colapsos de burbujas también puede causar daños letales a la célula e inducir efectos secundarios innecesarios en los alrededores. En aplicaciones sensibles como la apertura de la barrera hematoencefálica mediada por ultrasonido, generalmente se acepta que se deben evitar los colapsos de burbujas inerciales10.

Por lo tanto, actualmente se dedican grandes esfuerzos al diseño de secuencias de emisión de ultrasonidos, junto con el monitoreo y control pasivo de la cavitación, para garantizar oscilaciones estables de microburbujas11. En este régimen estable, se ha planteado la hipótesis de que las burbujas oscilantes estables juegan un papel importante en el desencadenamiento de la permeabilización de la membrana al promover el esfuerzo cortante espacialmente dirigido en la membrana celular7. El esfuerzo cortante resulta de los flujos de líquido creados en las proximidades de las burbujas oscilantes. Estos flujos de líquido se denominan micrortransmisión de cavitación y, como se mencionó anteriormente, son uno de los varios mecanismos posibles que son responsables de una mayor absorción de moléculas extracelulares. Cuando se trata de la suspensión de burbujas o células, como los ensayos de transfecciones biológicas in vitro12, la permeabilización por micrortransmisión podría ser mucho más eficiente que la permeabilización por colapso de burbujas. Esto se puede demostrar mediante una simple consideración geométrica. En las suspensiones celulares, la sonoporación será eficiente si la mayoría de las células suspendidas se someten a efectos mecánicos suficientemente grandes (lo que lleva a la permeabilización de la membrana). Se sabe que los colapsos de burbujas se dirigen a lo largo de la dirección de ruptura de la simetría isotrópica, como el eje13 de la pared de la burbuja o la burbuja-burbuja y la línea de células burbuja que unen su centro de masa14. El microchorro producido es, por lo tanto, un fenómeno espacialmente localizado a lo largo de un número finito de líneas que unen los centros celular y de burbuja. Dependiendo de la célula y la concentración de burbujas, así como de la distancia burbuja-celda, este efecto puede no ser el más eficiente para permeabilizar todo el número de células suspendidas. En contraste, la microtransmisión de cavitación es un fenómeno que ocurre en una escala de tiempo lenta, con una gran expansión espacial en comparación con el radio de la burbuja. Además, el flujo de líquido se distribuye alrededor de la burbuja y, por lo tanto, puede afectar a un mayor número de células, a un rango muy largo. Por lo tanto, comprender la microtransmisión de cavitación generada alrededor de una burbuja oscilante es un requisito previo para controlar y cuantificar el esfuerzo cortante inducido por burbujas que se aplica a las células.

Para ello, un paso preliminar consiste en controlar las oscilaciones esféricas y no esféricas de una burbuja impulsada por ultrasonidos, ya que los flujos de líquido generados son inducidos por el movimiento de la interfaz de la burbuja15,16. En particular, las oscilaciones de forma de las microburbujas deben activarse y mantenerse estables. Además, la orientación de las oscilaciones en forma de burbuja debe controlarse para analizar adecuadamente la correlación entre la dinámica de la interfaz de burbuja y el patrón de microstreaming inducido. Al resumir la literatura existente, es obvio que los resultados experimentales detallados de la microtransmisión inducida por cavitación solo están disponibles para burbujas adheridas a una superficie. Las microburbujas unidas a la pared se usan comúnmente para evaluar la dinámica precisa de la interfaz y las interacciones celulares a escala micrométrica bajo un sistema de microscopía ultrarrápida. Esta configuración es terapéuticamente relevante cuando se consideran microburbujas vibratorias localizadas en la membrana celular17,18,19. Sin embargo, el estudio de la burbuja unida al sustrato puede complicar el análisis de la dinámica de la burbuja, en parte debido a la naturaleza compleja de la dinámica de la línea de contacto20 y al desencadenamiento de modos de forma asimétrica21. En aplicaciones médicas y biológicas, las burbujas que no están unidas a una pared se encuentran comúnmente en geometrías confinadas, como vasos pequeños. Esto afecta significativamente la dinámica de burbujas y las inestabilidades de forma. En particular, la presencia de una pared cercana cambia el umbral de presión para el modo de forma, lo que se activa a valores de presión más bajos según el número de modo de forma y el tamaño de burbuja22. La pared también afecta el microstreaming inducido por burbujas con posiblemente mayor intensidad para el flujo producido23.

Entre todos los posibles escenarios que pueden experimentar las microburbujas (libres o adheridas, cerca de una pared, colapsando o oscilando establemente), proponemos investigar la dinámica no esférica de una sola burbuja lejos de cualquier límite. La configuración experimental se basa en un sistema de levitación acústica24 en el que se utiliza una onda de ultrasonido estacionaria para atrapar la burbuja. Este escenario es consistente con aplicaciones médicas en las que una colección de burbujas y células suspendidas coexisten en una cámara de sonotransfección, por ejemplo. En la medida en que las burbujas y las células no están demasiado cerca, se supone que la presencia de una célula no afecta la dinámica de la interfaz de burbujas. Cuando las células siguen las trayectorias en forma de bucle de la micrortransmisión inducida por cavitación, se acercan cíclicamente y repelen desde la ubicación de la burbuja y podemos suponer que la presencia celular no afecta ni al patrón de transmisión ni a su velocidad media. Además, la dinámica no esférica y la microtransmisión inducida desde burbujas individuales lejos del límite son bien conocidas desde un punto de vista teórico. Para vincular el flujo de líquido inducido por burbujas a la dinámica del contorno de burbujas, se requiere caracterizar con precisión la dinámica de la interfaz de burbujas. Para ello, es preferible adaptar la escala espaciotemporal en estudios experimentales con respecto a los utilizados en terapéutica para que la adquisición con cámaras comunes de alta velocidad (por debajo de 1 millón de fotogramas/segundo) sea posible mediante el uso de grandes burbujas excitadas a frecuencias más bajas. Cuando se consideran burbujas no recubiertas, la frecuencia propia ω n de un modo n dado está relacionada con el tamaño de la burbuja como Equation 125. Esta relación radio-frecuencia propia se modifica ligeramente cuando se consideran las burbujas con cáscara26, pero el orden de magnitud de la frecuencia propia ωn sigue siendo el mismo. Por lo tanto, la investigación de burbujas con radios de equilibrio ~ 50μm en un campo de ultrasonido de 30 kHz es similar al estudio de burbujas recubiertas de radios ~ 3μm en un campo de 1.7 MHz, como propone Dollet et al.27. Por lo tanto, se esperan números de modo de forma similares y, por lo tanto, patrones de microtransmisión.

Para desencadenar oscilaciones no esféricas de la interfaz de burbuja, es necesario exceder un cierto umbral de presión que depende del radio, como se muestra en la Figura 1. Las técnicas experimentales existentes se basan en el aumento de la presión acústica para activar los modos de superficie (ilustrado por la trayectoria (1) en la Figura 1), ya sea por aumento de presión paso a paso28 o por excitación de amplitud modulada responsable del inicio periódico y la extinción de los modos de superficie29. Los principales inconvenientes de estas técnicas son (i) una orientación aleatoria del eje de simetría de las oscilaciones superficiales que no se puede controlar para que estén en el plano de imagen, (ii) una corta vida útil de las oscilaciones en forma de burbuja que dificulta el análisis de los flujos de líquido inducidos en escalas de tiempo más grandes, y (iii) la activación frecuente de modos de forma inestables. Proponemos una técnica alternativa para cruzar el umbral de presión a una presión acústica constante en el mapa de radio/presión, como se ilustra en la trayectoria (2) de la Figura 1. Para ello, se requiere aumentar el tamaño de la burbuja de tal manera que esté en la zona de inestabilidad. Tal aumento se realiza mediante una técnica de coalescencia de burbujas. La coalescencia de dos microburbujas, inicialmente oscilantes esféricamente, se explota para crear una sola burbuja deformada. Si la presión acústica y el tamaño de burbuja de la burbuja fusionada están en la zona de inestabilidad, se activan los modos de superficie. También evidenciamos que la técnica de coalescencia induce oscilaciones de forma estables en un régimen de estado estacionario, así como un eje de simetría controlado definido por el movimiento rectilíneo de las dos burbujas que se aproximan. Debido a que se garantiza una oscilación de forma estable durante minutos, el análisis del flujo de fluido inducido por burbujas es posible sembrando el medio líquido con micropartículas fluorescentes, iluminadas por una lámina láser delgada. El registro del movimiento de las micropartículas sólidas en las proximidades de la interfaz de burbujas permite identificar el patrón del flujo de fluido inducido30. El principio general de la activación de oscilaciones en forma de burbuja, que conduce a un flujo de fluido estable en el tiempo, se ilustra en la Figura 2.

En el siguiente protocolo, describimos los pasos necesarios para crear oscilaciones estables en forma de burbuja a través de la técnica de coalescencia y describimos las mediciones del flujo de fluido. Esto incluye el diseño del sistema de levitación acústica, la calibración acústica, la nucleación de burbujas y la técnica de coalescencia, la medición de la dinámica de la interfaz de burbujas y el flujo de fluido circundante, y el procesamiento de imágenes.

Protocol

1. Diseño de la cámara de levitación acústica Diseñe un tanque cúbico ópticamente transparente (similar al PMMA) (8 cm de borde y 2,8 mm de espesor por cara) con el módulo de geometría de un software de simulación multifísica (Tabla de materiales). Inserte una superficie cilíndrica (Ø = 35 mm) centrada en la parte inferior del tanque, para modelar el transductor ultrasónico. Ajuste las condiciones de contorno a presión cero en cada pared con un desplazamiento …

Representative Results

En la Figura 9 se presenta una secuencia completa de coalescencia de burbujas que conduce a oscilaciones no esféricas estables en el tiempo y controladas por simetría. La fase de aproximación de dos burbujas oscilantes esféricamente termina cuando se rompe la delgada película líquida entre las dos burbujas. Vale la pena señalar que, en la última etapa anterior a la coalescencia, las interfaces de burbuja se desvían de la esfericidad. Ambas burbujas s…

Discussion

El procedimiento presentado consiste en utilizar la coalescencia de burbujas para desencadenar oscilaciones en forma de burbuja controladas por simetría en estado estacionario, lo que permite estudiar el flujo de fluido a largo plazo inducido por estas oscilaciones. El principal desafío en la técnica es el control de oscilaciones no esféricas para una burbuja atrapada, lejos de cualquier límite.

La mayoría de las técnicas existentes propuestas en la literatura se centraron en burbujas u…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el LabEx CeLyA de la Universidad de Lyon (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).

Materials

Aspherical lens Thorlabs AL4050 Lens of focus 40 mm
Continuous wave laser source CNI MLL6FN DPSS laser of wavelength 532nm, energy 400 mW
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LJ1277L1-A lens of focus -25?4mm
Cylindrical plano-concave lens Thorlabs LK1900L1 lens of focus 250 mm
Fluorescent particles Duke Scientific R700 Red polymer fluorescent microspheres
Function generator Agilent HP33120 Generator of function feeding the ultrasound transducer
High-speed camera Vision Research Phantom v12.0 High-speed recording up to 1 Mfps
Liquid medium Carlo Erba Water for analysis Demineralized, undegassed water
Multiphysics software Comsol None Softwate for simulating the acoustic field of the levitation chamber
Nd:Yag pulsed laser New Wave Research Solo III-15 5 ns pulse duration, λ=532 nm, 3.5 mm beam diameter, up to 50 mJ
Plano-concave lens Thorlabs N-BK7 lens of focus 125 mm
Spherical concave lens Thorlabs N-SF11 Bi-concave lens of focus -25mm
Ultrasound transducer SinapTec Custom-made Nominal frequency 31kHz, active area 35mm diameter
Visualization software NIH ImageJ Software for image processing and analysis in Java
XY Linear stage Newport M-406 Displacement stage with micrometric screw
Z-axis linear stage Edmund Optics 62-299 Vertical displacement stage with micrometric screw

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Citazione di questo articolo
Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Induction of Microstreaming by Nonspherical Bubble Oscillations in an Acoustic Levitation System. J. Vis. Exp. (171), e62044, doi:10.3791/62044 (2021).

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