JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة روتينية لاستخدام المجهر الإلكتروني للمسح التسلسلي لوجه الكتلة (SBF-SEM)، وهي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد قوية. يعتمد التطبيق الناجح ل SBF-SEM على تقنيات التثبيت وتلطيخ الأنسجة المناسبة ، بالإضافة إلى النظر بعناية في إعدادات التصوير. ويتضمن هذا البروتوكول اعتبارات عملية لهذه العملية برمتها.

Abstract

يسمح المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) بجمع مئات إلى آلاف الصور فائقة الهيكلة المسجلة بشكل متسلسل ، مما يوفر رؤية ثلاثية الأبعاد غير مسبوقة لاستئصال الأنسجة الدقيقة. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه. يستفيد نظام التصوير هذا من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد. ومع ذلك، دون إعداد الأنسجة المناسبة البنية الفوقية الخلوية يمكن تغييرها بطريقة يمكن استخلاص استنتاجات غير صحيحة أو مضللة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء الصور عن طريق مسح الوجه الكتلي لعينة بيولوجية مضمنة في الراتنج، وهذا غالبا ما يمثل تحديات واعتبارات يجب معالجتها. تراكم الإلكترونات داخل الكتلة أثناء التصوير، والمعروفة باسم “شحن الأنسجة”، يمكن أن يؤدي إلى فقدان التباين وعدم القدرة على تقدير الهيكل الخلوي. وعلاوة على ذلك، في حين أن زيادة كثافة شعاع الإلكترون / الجهد أو خفض سرعة مسح شعاع يمكن أن تزيد من دقة الصورة، وهذا يمكن أن يكون أيضا الآثار الجانبية المؤسفة من إتلاف كتلة الراتنج وتشويه الصور اللاحقة في سلسلة التصوير. هنا نقدم بروتوكول روتيني لإعداد عينات الأنسجة البيولوجية التي تحافظ على البنية الفوقية الخلوية ويقلل من شحن الأنسجة. كما نقدم اعتبارات التصوير للحصول السريع على صور تسلسلية عالية الجودة مع الحد الأدنى من الضرر لكتلة الأنسجة.

Introduction

تم وصف المجهر الإلكتروني (SBF-SEM) لأول مرة من قبل Leighton في عام 1981 حيث صمم مجهرا إلكترون المسح الضوئي معززا بفغر صغير مدمج يمكن أن يقطع ويصور أقساما رقيقة من الأنسجة المضمنة في الراتنج. لسوء الحظ، القيود التقنية حصرت استخدامه في العينات التوصيلية، حيث تراكمت عينات غير موصلة مثل الأنسجة البيولوجية مستويات غير مقبولة من الشحن (تراكم الإلكترون داخل عينة الأنسجة)1. في حين طلاء كتلة الوجه بين التخفيضات مع الكربون المتبخر خفض شحن الأنسجة، وهذا الوقت زيادة كبيرة في اقتناء التصوير وتخزين الصور ظلت مشكلة كما تكنولوجيا الكمبيوتر في ذلك الوقت لم تكن كافية لإدارة أحجام الملفات الكبيرة التي أنشأها الجهاز. تمت إعادة النظر في هذه المنهجية من قبل دنك وهورستمان في عام 2004 باستخدام SBF-SEM مجهزة بغرفة ضغطمتغيرة 2. وقد سمح ذلك بإدخال بخار الماء إلى غرفة التصوير مما يقلل من الشحن داخل العينة ، مما يجعل تصوير العينات غير التوصيلية قابلا للتطبيق وإن كان مع فقدان دقة الصورة. مزيد من التحسينات في إعداد الأنسجة وطرق التصوير تسمح الآن للتصوير باستخدام فراغ عالية، والتصوير SBF-SEM لم يعد يعتمد على بخار الماء لتبديل الشحن3،4،5،6،7،8،9. في حين شهدت SBF-SEM زيادة هائلة في الاستخدام في السنوات الأخيرة ، فإن الجوانب التقنية مثل إعداد الأنسجة السليمة ومعلمات التصوير لها أهمية قصوى لنجاح طريقة التصوير هذه.

SBF-SEM يسمح لجمع الآلي من الآلاف من الصور المجهر الإلكتروني المسجلة تسلسليا، مع قرار مستو صغيرة مثل 3-5 نانومتر10،11. يتم وضع الأنسجة، المشربة بالمعادن الثقيلة والمضمنة في الراتنج، داخل المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) التي تحتوي على بروتين فائق مزود بسكين الماس. يتم قطع سطح مستو بسكين الماس ، ويتم سحب السكين ، ويتم مسح سطح الكتلة في نمط النقطية مع شعاع الإلكترون لإنشاء صورة للبنية فوقية الأنسجة. ثم يتم رفع الكتلة كمية محددة (على سبيل المثال، 100 نانومتر) في المحور z، والمعروفة باسم “خطوة z”، ويتم قطع سطح جديد قبل تكرار العملية. وبهذه الطريقة يتم إنتاج كتلة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من الصور أثناء قطع الأنسجة. يستفيد نظام التصوير هذا بشكل أكبر من الطبيعة الآلية للجهاز ، مما يسمح للمرء بترك المجهر دون مراقبة أثناء عملية التصوير ، مع إمكانية جمع مئات الصور تلقائيا في يوم واحد.

في حين أن التصوير SBF-SEM يستخدم في المقام الأول الإلكترونات المكثرة لتشكيل صورة لوجه الكتلة ، يتم إنشاء الإلكترونات الثانوية أثناء عملية التصوير12. يمكن أن تتراكم الإلكترونات الثانوية ، إلى جانب الإلكترونات المكبتة والحزمة الأولية التي لا تفلت من الكتلة ، وتنتج “شحن الأنسجة” ، مما يمكن أن يؤدي إلى حقل كهربائي محلي في وجه الكتلة. يمكن أن يشوه تراكم الإلكترون هذا الصورة أو يتسبب في إخراج الإلكترونات من الكتلة والمساهمة في الإشارة التي يجمعها كاشف الرواصد الخلفي ، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء13. في حين يمكن خفض مستوى شحن الأنسجة عن طريق تقليل الجهد شعاع الإلكترون أو كثافة، أو تقليل وقت الإسهاب شعاع، وهذا يؤدي إلى انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء14. عندما يتم استخدام شعاع إلكترون من الجهد المنخفض أو الكثافة ، أو يسمح للشعاع فقط بالسكن داخل كل مساحة بكسل لفترة أقصر من الزمن ، يتم إخراج الإلكترونات الأقل تشتتا من الأنسجة والتقاطها بواسطة كاشف الإلكترونات مما يؤدي إلى إشارة أضعف. تعامل دنك وهورستمان مع هذه المشكلة من خلال إدخال بخار الماء إلى الغرفة ، وبالتالي تقليل الشحن في الغرفة وعلى وجه الكتلة على حساب دقة الصورة. مع ضغط غرفة من 10-100 السلطة الفلسطينية، وتناثر جزء من شعاع الإلكترون المساهمة في ضوضاء الصورة وفقدان الدقة، ولكن هذا ينتج أيضا أيونات في غرفة العينة التي تحييد تهمة داخل كتلة العينة2. أساليب أكثر حداثة لتحييد تهمة داخل كتلة عينة استخدام حقن الغاز البؤري من النيتروجين على كتلة الوجه أثناء التصوير، أو إدخال الجهد السلبي إلى مرحلة SBF-SEM لتقليل طاقة المسبار شعاع الشحن وزيادةإشارةجمعت 6،7،15. بدلا من إدخال التحيز المرحلة، ضغط الغرفة أو حقن النيتروجين المترجمة لتقليل تراكم تهمة على سطح الكتلة، فمن الممكن أيضا لزيادة الموصلية من الراتنج عن طريق إدخال الكربون إلى مزيج الراتنج السماح لإعدادات التصوير أكثر عدوانية16. البروتوكول العام التالي هو تكييف لبروتوكول Deerinck et al. الذي نشر في عام 2010 ويغطي التعديلات على منهجيات إعداد الأنسجة والتصوير التي وجدناها مفيدة لتقليل شحن الأنسجة مع الحفاظ على اكتساب صورة عالية الدقة3و17و18و19. في حين أن البروتوكول المذكور سابقا ركز على معالجة الأنسجة وتلقيح المعادن الثقيلة ، يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة في سير عمل التصوير وتحليل البيانات وإعادة الإعمار المتأصل في دراسات SBF-SEM. في مختبرنا، تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح واستنساخ على مجموعة واسعة من الأنسجة بما في ذلك القرنية وهياكل الجزء الأمامي، الجفن، الغدة الكظرية والأصعب، شبكية العين والعصب البصري، القلب، الرئة والمجرى الهوائي، الكلى، الكبد، عضلة كريماستر، والقشرة الدماغية / النخاع، وفي مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الماوس، الفئران، الأرانب، خنزير غينيا، الأسماك، أحادي الطبقة وثقافات الخلايا الطبقية، الخنزير، الرئيسيات غير البشرية، وكذلك الإنسان20،21،22،23. في حين أن التغييرات الصغيرة قد تكون جديرة بالاهتمام بالنسبة لأنسجة وتطبيقات محددة ، فقد أثبت هذا البروتوكول العام أنه قابل للاستنساخ ومفيد للغاية في سياق منشأة التصوير الأساسية لدينا.

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الموصوفة في بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون لاستخدام الحيوانات في أبحاث الرؤية وطب العيون وكلية هيوستن للمبادئ التوجيهية للتعامل مع الحيوانات البصريات. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل المؤسسات التي تم التعامل ?…

Representative Results

ماوس كورنياتم تطبيق هذا البروتوكول بشكل مكثف على قرنية الماوس. باستخدام التصوير SBF-SEM شبكة من حزم الألياف الدقيقة الخالية من الإيلاستين (EFMBs) تبين أن تكون موجودة داخل القرنية الماوس الكبار. وكان يعتقد في السابق أن هذه الشبكة لم تكن موجودة إلا أثناء النمو الجنيني والمبكر بعد الول?…

Discussion

الغرض من ورقة الأساليب هذه هو تسليط الضوء على منهجية إعداد الأنسجة والتصوير التي سمحت لمختبرنا بالتقاط صور المجهر الإلكتروني التسلسلي عالية الدقة بشكل موثوق ، والإشارة إلى الخطوات الحاسمة التي تؤدي إلى هذه النتيجة وكذلك المزالق المحتملة التي يمكن أن تحدث عند إجراء التصوير SBF-SEM. النجاح ب?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نشكر الدكتور سام هانلون وإيفلين براون ومارغريت غوندو على مساعدتهم التقنية الممتازة. تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 EY-018239 و P30 EY007551 (المعهد الوطني للعيون) ، جزئيا من قبل مؤسسة الأسد للبصر ، وجزؤا من قبل NIH 1R15 HD084262-01 (المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية).

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we–where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscienze. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Tags

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)Heavy Metal StainingResin InfiltrationAutomated Image Capture
check_url/it/62045?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image