Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver

Summary

Denne protokol skitserer en rutinemæssig metode til brug af seriel blok-ansigt scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), en kraftfuld 3D-billedbehandling teknik. Vellykket anvendelse af SBF-SEM afhænger af korrekt fiksering og væv farvning teknikker, samt omhyggelig overvejelse af billedbehandling indstillinger. Denne protokol indeholder praktiske overvejelser for hele denne proces.

Abstract

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) giver mulighed for indsamling af hundreder til tusinder af serielt registrerede ultrastrukturelle billeder, der tilbyder en hidtil uset tre-dimensionel visning af væv mikroanatomi. Mens SBF-SEM har oplevet en eksponentiel stigning i brugen i de seneste år, tekniske aspekter såsom korrekt vævsforberedelse og billeddannelse parametre er altafgørende for succesen af denne billeddannelse modalitet. Dette billedsystem drager fordel af enhedens automatiserede karakter, så man kan forlade mikroskopet uden opsyn under billedprocessen, med automatiseret indsamling af hundredvis af billeder muligt på en enkelt dag. Men uden passende vævsforberedelse kan cellulær ultrastruktur ændres på en sådan måde, at der kan drages forkerte eller vildledende konklusioner. Derudover genereres billeder ved at scanne blokfladen af en harpiks-indlejret biologisk prøve, og dette giver ofte udfordringer og overvejelser, der skal løses. Akkumulering af elektroner i blokken under billeddannelse, kendt som “vævsopladning”, kan føre til tab af kontrast og manglende evne til at værdsætte cellulær struktur. Desuden, mens øge elektronstråle intensitet / spænding eller faldende stråle-scanning hastighed kan øge billedopløsningen, kan dette også have den uheldige bivirkning at beskadige harpiks blok og fordreje efterfølgende billeder i billedbehandling serien. Her præsenterer vi en rutinemæssig protokol til fremstilling af biologiske vævsprøver, der bevarer cellulær ultrastruktur og mindsker vævsopladning. Vi leverer også billedbehandling overvejelser for hurtig erhvervelse af høj kvalitet seriebilleder med minimal skade på væv blok.

Introduction

Seriel blok ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) blev første gang beskrevet af Leighton i 1981, hvor han formet en scanning elektron mikroskop forstærket med en indbygget mikrotomi, som kunne skære og billede tynde dele af væv indlejret i harpiks. Desværre begrænsede tekniske begrænsninger brugen til ledende prøver, da ikke-ledende prøver såsom biologisk væv akkumulerede uacceptable opladningsniveauer (elektronoprustning i vævsprøven)¹. Mens belægning blok-ansigt mellem nedskæringer med fordampet kulstof reduceret væv opladning, dette i høj grad øget billedbehandling erhvervelse tid og billedlagring forblev et problem som computerteknologi på det tidspunkt var utilstrækkelig til at styre de store filstørrelser skabt af enheden. Denne metode blev revideret af Denk og Horstmann i 2004 ved hjælp af et SBF-SEM udstyret med et variabelt trykkammer². Dette gjorde det muligt at indføre vanddamp i billedkammeret, hvilket reducerer opladningen i prøven, hvilket gør billeddannelse af ikke-ledende prøver levedygtig, omend med tab af billedopløsning. Yderligere forbedringer i vævsforberedelse og billeddannelsesmetoder giver nu mulighed for billeddannelse ved hjælp af højt vakuum, og SBF-SEM-billeddannelse er ikke længere afhængig af vanddamp for at sprede opladning^3,4^,5,6,7,8,9. Mens SBF-SEM har oplevet en eksponentiel stigning i brugen i de seneste år, tekniske aspekter såsom korrekt vævsforberedelse og billeddannelse parametre er altafgørende for succesen af denne billeddannelse modalitet.

SBF-SEM giver mulighed for automatiseret indsamling af tusindvis af serielt registrerede elektronmikroskopibilleder med planaropløsning helt op til 3-5 nm^10,11. Væv, imprægneret med tungmetaller og indlejret i harpiks, er placeret i en scanning elektron mikroskop (SEM) indeholder en ultramikromitomi udstyret med en diamant kniv. En flad overflade skæres med diamantkniven, kniven trækkes tilbage, og overfladen af blokken scannes i et rastermønster med en elektronstråle for at skabe et billede af vævs ultrastruktur. Blokken hæves derefter en bestemt mængde (f.eks. 100 nm) i z-aksen, kendt som et “z-trin”, og en ny overflade skæres, før processen gentages. På denne måde produceres en 3-dimensionel (3D) blok af billeder, når vævet skæres væk. Dette billedsystem drager yderligere fordel af enhedens automatiserede karakter, så man kan forlade mikroskopet uden opsyn under billeddannelsesprocessen, med automatiseret samling af hundreder af billeder muligt på en enkelt dag.

Mens SBF-SEM-billeddannelse primært bruger backscattered elektroner til at danne et billede af blokfladen, genereres sekundære elektroner under billedprocessen¹². Sekundære elektroner kan ophobes sammen med backscattered og primærstråleelektroner, der ikke undslipper blokken, og producere “vævsopladning”, hvilket kan føre til et lokaliseret elektrostatisk felt ved blokfladen. Denne elektronakkumulering kan forvrænge billedet eller få elektroner til at blive skubbet ud af blokken og bidrage til det signal, der indsamles af backscatter-detektoren, hvilket reducerer signal-til-støj-forholdet¹³. Mens niveauet af vævsopladning kan reduceres ved at reducere elektronstrålespændingen eller intensiteten eller reducere strålebotiden, resulterer dette i et formindsket signal-til-støj-forhold¹⁴. Når der anvendes en elektronstråle med lavere spænding eller intensitet, eller strålen kun må dvæle inden for hver pixelplads i en kortere periode, skubbes mindre backscattered elektroner ud af vævet og fanges af elektrondetektoren, hvilket resulterer i et svagere signal. Denk og Horstmann håndterede dette problem ved at indføre vanddamp i kammeret og derved reducere ladning i kammeret og på blokfladen på bekostning af billedopløsning. Med et kammertryk på 10-100 Pa spredes en del af elektronstrålen, hvilket bidrager til billedstøj og tab af opløsning, men dette giver også ioner i prøvekammeret, som neutraliserer ladning i prøveblok². Nyere metoder til neutralisering af ladning i prøveblokken bruger fokal gasindsprøjtning af nitrogen over blokfladen under billeddannelse eller til at indføre negativ spænding til SBF-SEM-fasen for at reducere sondestråle-smedeenergi og øge signal indsamlet^6,7,15. I stedet for at indføre fase bias, kammertryk eller lokaliseret kvælstofindsprøjtning for at reducere ladningsopbygning på blokoverfladen, er det også muligt at øge harpiksens ledningsevne ved at introducere kulstof til harpiksblandingen, hvilket giver mulighed for mere aggressive billedindstillinger¹⁶. Følgende generelle protokol er en tilpasning af Deerinck et al. protokollen offentliggjort i 2010 og dækker ændringer af vævsforberedelse og billeddannelsesmetoder, som vi fandt nyttige til at minimere vævsopladning, samtidig med at vi opretholdt billedopsamling i høj opløsning^3,17,18,19. Mens den tidligere nævnte protokol fokuserede på vævsbehandling og tungmetalimprægnering, giver denne protokol indsigt i den billeddannelse, dataanalyse og genopbygningsarbejdsgang, der er forbundet med SBF-SEM-undersøgelser. I vores laboratorium er denne protokol blevet anvendt med succes og reproducerbart på en lang række væv, herunder hornhinde- og forreste segmentstrukturer, øjenlåg, lacrimal og harderian kirtel, nethinden og synsnerven, hjerte, lunge og luftveje, nyre, lever, cremaster muskel, og hjernebark / medulla, og i en række arter, herunder mus, rotte, kanin, marsvin, fisk, monolayer og stratificeret cellekulturer, svin, ikke-menneskelige primat, samt^{humane 20,21,22,23}. Mens små ændringer kan være umagen værd for specifikke væv og applikationer, har denne generelle protokol vist sig meget reproducerbar og nyttig i forbindelse med vores kernebilledbehandling facilitet.

Protocol

Alle dyr blev håndteret i henhold til de retningslinjer, der er beskrevet i Association for Research in Vision and Oftalmologi Statement for the Use of Animals in Vision and Oftalmic Research og University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dyreforsøg blev godkendt af de institutioner, hvor de blev håndteret: Mus, rotte, kanin, marsvin og ikke-menneskelige primatprocedurer blev godkendt af University of Houston Animal Care and Use Committee, zebrafiskprocedurer blev godkendt af DePauw Uni…

Representative Results

Mus HornhindenDenne protokol er blevet anvendt i vid udstrækning på musen hornhinden. Ved hjælp af SBF-SEM-billeddannelse viste det sig, at et netværk af elastinfri mikrokortbundter (EFMB’er) var til stede i hornhinden med voksne mus. Det blev tidligere antaget, at dette netværk kun var til stede under embryonale og tidlige postnatal udvikling. SBF-SEM afslørede et omfattende EFMB-netværk i hele hornhinden, med individuelle fibre fundet at være 100-200 nm i diameter målt i tværsnit. Det ble…

Discussion

Formålet med denne metode papir er at fremhæve væv forberedelse og billeddannelse metode, der har gjort det muligt for vores laboratorium til pålideligt at fange høj opløsning seriel elektron mikroskopi billeder, og at påpege kritiske skridt, der fører til dette resultat samt potentielle faldgruber, der kan opstå, når de udfører SBF-SEM billeddannelse. Succes med at bruge denne protokol kræver korrekt fiksering af væv, imprægnering af tungmetaller i prøven, modifikationer af indlejringsharpiksen for at red…

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver	Wiha Quality Tools	27225
Acetone	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A8949
Calcium Chloride	FisherScientific	C79-500
Conductive Silver Paint	Ted Pella	16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target	Denton Vacuum	N/A	This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812	Electron Microscopy Sciences	14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM	Gatan & Tescan	N/A	This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml)	Electron Microscopy Sciences	72630-05
Gluteraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough	NA	NA	Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	Refered to as carbon black in text.
KOH	FisherScientific	18-605-593
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L62-100
Microwave	Pelco	BioWave Pro	This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide	Sigma-Aldrich	201030
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P9387
Silicone Embedding Mold	Ted Pella	10504
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco Transfer Pipette	ThermoFisher Scientific	202	Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files	Electron Microscopy Sciences	62115
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich	223220
Uranyl Acetate	Polysciences, Inc.	21447-25
Reconstruction Software
Amira Software	Thermo Scientific	N/A	Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ)	ImageJ.net	N/A	TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB)	University of Helsinki, Institute of Biotechnology	N/A
Reconstuct Software	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & The University of Nottingham	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.