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Biologia

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

Este protocolo delinea un método rutinario para usar la microscopia electrónica serial de la exploración de la bloque-cara (SBF-SEM), una técnica de proyección de imagen 3D potente. El uso acertado de SBF-SEM depende de técnicas apropiadas de la fijación y de la coloración del tejido, así como de la consideración cuidadosa de los ajustes de la proyección de imagen. Este protocolo contiene consideraciones prácticas para la totalidad de este proceso.

Abstract

La microscopia electrónica serial de la bloque-cara de la exploración (SBF-SEM) permite la colección de centenares a millares de imágenes ultraestructurales en serie-registradas, ofreciendo una vista tridimensional sin precedentes del tejido microanatomy. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen. Este sistema de imágenes se beneficia de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día. Sin embargo, sin la preparación apropiada del tejido la ultraestructura celular se puede alterar de una manera tal que las conclusiones incorrectas o engañosas pudieran ser dibujadas. Además, las imágenes se generan escaneando la cara de bloque de una muestra biológica incrustada en resina y esto a menudo presenta desafíos y consideraciones que deben abordarse. La acumulación de electrones dentro del bloque durante la proyección de imagen, conocida como “carga del tejido,” puede llevar a una pérdida de contraste y a una inhabilidad de apreciar la estructura celular. Además, si bien el aumento de la intensidad/voltaje del haz de electrones o la disminución de la velocidad de escaneo del haz pueden aumentar la resolución de la imagen, esto también puede tener el desafortunado efecto secundario de dañar el bloque de resina y distorsionar las imágenes posteriores en la serie de imágenes. Aquí presentamos un protocolo de rutina para la preparación de muestras de tejido biológico que preserva la ultraestructura celular y disminuye la carga tisular. También proporcionamos las consideraciones de la proyección de imagen para la adquisición rápida de serial-imágenes de alta calidad con daño mínimo al bloque del tejido.

Introduction

La microscopía electrónica de barrido facial de bloques en serie (SBF-SEM) fue descrita por primera vez por Leighton en 1981, donde creó un microscopio electrónico de barrido aumentado con un microtomo incorporado que podía cortar e imaginar secciones delgadas de tejido incrustadas en resina. Desafortunadamente, las limitaciones técnicas restringieron su uso a muestras conductoras, ya que las muestras no conductoras, como el tejido biológico, acumularon niveles inaceptables de carga (acumulación de electrones dentro de la muestra de tejido)1. Si bien el recubrimiento de la cara de bloque entre cortes con carbono evaporado redujo la carga de tejido, esto aumentó en gran medida el tiempo de adquisición de imágenes y el almacenamiento de imágenes siguió siendo un problema, ya que la tecnología informática en ese momento era insuficiente para administrar los grandes tamaños de archivo creados por el dispositivo. Esta metodología fue revisada por Denk y Horstmann en 2004 utilizando un SBF-SEM equipado con una cámara de presión variable2. Esto permitió la introducción de vapor de agua a la cámara de imágenes, lo que reduce la carga dentro de la muestra, haciendo que las imágenes de muestras no conductoras sean viables, aunque con una pérdida de resolución de imagen. Las mejoras adicionales en la preparación del tejido y los métodos de la proyección de imagen ahora permiten la proyección de imagen usando el alto vacío, y la proyección de imagen de SBF-SEM confía no más en el vapor de agua para disipar la carga3,4,5,6,7,8,9. Mientras que SBF-SEM ha visto un aumento exponencial en uso estos últimos años, los aspectos técnicos tales como preparación apropiada del tejido y parámetros de la proyección de imagen son supremos para el éxito de esta modalidad de la proyección de imagen.

SBF-SEM permite la recolección automatizada de miles de imágenes de microscopía electrónica registradas en serie, con una resolución plana tan pequeña como 3-5 nm10,11. El tejido, impregnado con metales pesados e incrustado en resina, se coloca dentro de un microscopio electrónico de barrido (SEM) que contiene un ultramicrotomo equipado con un cuchillo de diamante. Una superficie plana se corta con el cuchillo de diamante, el cuchillo se retrae y la superficie del bloque se escanea en un patrón ráster con un haz de electrones para crear una imagen de ultraestructura de tejido. A continuación, el bloque se eleva una cantidad especificada (por ejemplo, 100 nm) en el eje z, conocido como “paso z”, y se corta una nueva superficie antes de que se repita el proceso. De esta manera se produce un bloque de imágenes de 3 dimensiones (3D) a medida que se corta el tejido. Este sistema de imágenes se beneficia aún más de la naturaleza automatizada del dispositivo, lo que permite dejar el microscopio desatendido durante el proceso de obtención de imágenes, con la recopilación automatizada de cientos de imágenes posibles en un solo día.

Mientras que las imágenes SBF-SEM utilizan principalmente electrones retrosperdicionados para formar una imagen de la cara de bloque, los electrones secundarios se generan durante el proceso de obtención de imágenes12. Los electrones secundarios pueden acumularse, junto con los electrones retrospersión y de haz primario que no escapan del bloque, y producen “carga de tejido”, lo que puede conducir a un campo electrostático localizado en la cara del bloque. Esta acumulación de electrones puede distorsionar la imagen o hacer que los electrones sean expulsados del bloque y contribuir a la señal recogida por el detector de retrospersión, disminuyendo la relación señal/ruido13. Mientras que el nivel de carga del tejido puede disminuirse reduciendo el voltaje o la intensidad del haz de electrones, o reduciendo el tiempo de permanencia del haz, esto resulta en una relación señal/ruido disminuida14. Cuando se utiliza un haz de electrones de menor voltaje o intensidad, o el haz solo puede habitar dentro de cada espacio de píxeles durante un período de tiempo más corto, menos electrones retrodispersión son expulsados del tejido y capturados por el detector de electrones, lo que resulta en una señal más débil. Denk y Horstmann abordaron este problema introduciendo vapor de agua en la cámara, reduciendo así la carga en la cámara y en la cara del bloque a costa de la resolución de la imagen. Con una presión de cámara de 10-100 Pa, una parte del haz de electrones se dispersa contribuyendo al ruido de la imagen y una pérdida de resolución, sin embargo, esto también produce iones en la cámara de la muestra que neutraliza la carga dentro del bloque de muestra2. Los métodos más recientes para neutralizar la carga dentro del bloque de muestra utilizan la inyección focal de gas de nitrógeno sobre la cara del bloque durante la toma de imágenes, o la introducción de voltaje negativo en la etapa SBF-SEM para disminuir la energía de la sonda-haz-lading y aumentar la señal recogida6,7,15. En lugar de introducir sesgo de etapa, presión de cámara o inyección localizada de nitrógeno para disminuir la acumulación de carga en la superficie del bloque, también es posible aumentar la conductividad de la resina mediante la introducción de carbono en la mezcla de resina, lo que permite ajustes de imagen más agresivos16. El siguiente protocolo general es una adaptación del protocolo de Deerinck et al. publicado en 2010 y cubre las modificaciones en la preparación de tejidos y las metodologías de imagen que encontramos útiles para minimizar la carga de tejidos mientras se mantiene la adquisición de imágenes de alta resolución3,17,18,19. Mientras que el protocolo previamente mencionado se centró en el proceso del tejido y la impregnación del metal pesado, este protocolo proporciona la penetración en la proyección de imagen, el análisis de datos, y el flujo de trabajo de la reconstrucción inherentes a los estudios de SBF-SEM. En nuestro laboratorio, este protocolo se ha aplicado con éxito y reproduciblemente a una amplia variedad de tejidos, incluyendo córnea y estructuras del segmento anterior, párpado, glándula lagrimal y harderiana, retina y nervio óptico, corazón, pulmón y vía aérea, riñón, hígado, músculo cremaster y corteza cerebral / médula, y en una variedad de especies que incluyen ratón, rata, conejo, conejillo de Indias, peces, monocapa y cultivos celulares estratificados, cerdo, primate no humano, así como humanos20,21,22,23. Mientras que los pequeños cambios pueden valer la pena para tejidos y aplicaciones específicos, este protocolo general ha demostrado ser altamente reproducible y útil en el contexto de nuestra instalación de imágenes principales.

Protocol

Todos los animales fueron manejados de acuerdo con las pautas descritas en la Declaración de manejo de animales para el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica de la Universidad de Houston y la Facultad de Optometría de la Universidad de Houston. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por las instituciones en las que se manejaron: los procedimientos de ratón, rata, conejo, conejillo de Indias y primates no humanos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Un…

Representative Results

Córnea del ratónEste protocolo se ha aplicado extensivamente a la córnea del ratón. Usando proyección de imagen de SBF-SEM una red de paquetes elastino-libres de la microfibrrilla (EFMBs) fue mostrado para estar presente dentro de la córnea adulta del ratón. Se creía previamente que esta red sólo estaba presente durante el desarrollo embrionario y postnatal temprano. SBF-SEM reveló una extensa red EFMB en toda la córnea, con fibras individuales encontradas para ser 100-200 nanómetro de di…

Discussion

El propósito de este papel de los métodos es destacar la preparación del tejido y la metodología de la proyección de imagen que ha permitido que nuestro laboratorio capture confiablemente imágenes seriales de alta resolución de la microscopia electrónica, y señalar los pasos críticos que llevan a este resultado así como las trampas potenciales que pueden ocurrir al conducir proyección de imagen de SBF-SEM. El éxito en el uso de este protocolo requiere la fijación adecuada del tejido, la impregnación de met…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown y Margaret Gondo por su excelente asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada en parte por los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) R01 EY-018239 y P30 EY007551 (Instituto Nacional del Ojo), en parte por la Fundación del León para la Vista, y en parte por nih 1R15 HD084262-01 (Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano).

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
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Riferimenti

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Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
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