JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Published: March 26, 2021
doi:
10.3791/62045
, , , , , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Department of Biology,DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center,Baylor College of Medicine

Summary

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM’in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Abstract

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM), doku mikroatominin eşi görülmemiş üç boyutlu görünümünü sunan yüzlerce ila binlerce seri kayıtlı ultrayapısal görüntünün toplanmasına izin verir. SBF-SEM’de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar. Bununla birlikte, uygun doku hazırlığı olmadan hücresel ultrayapı, yanlış veya yanıltıcı sonuçlar çıkarılacak şekilde değiştirilebilir. Ayrıca, görüntüler reçine gömülü biyolojik örneğin blok yüzünün taranarak oluşturulur ve bu genellikle ele alınması gereken zorluklar ve hususlar sunar. “Doku şarjı” olarak bilinen görüntüleme sırasında blok içinde elektronların birikmesi, kontrast kaybına ve hücresel yapıyı takdir edememesine neden olabilir. Ayrıca, elektron ışını yoğunluğunu / voltajını artırmak veya ışın tarama hızını azaltmak görüntü çözünürlüğünü artırabilirken, bu aynı zamanda reçine bloğuna zarar vermenin ve görüntüleme serisindeki sonraki görüntüleri bozmanın talihsiz yan etkisine sahip olabilir. Burada hücresel ultrayapıyı koruyan ve doku şarjını azaltan biyolojik doku örneklerinin hazırlanması için rutin bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, doku bloğunda en az hasarla yüksek kaliteli seri görüntülerin hızlı bir şekilde elde edilmesi için görüntüleme hususları sağlıyoruz.

Introduction

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi (SBF-SEM) ilk olarak 1981 yılında Leighton tarafından reçineye gömülü dokunun ince bölümlerini kesebilen ve görüntüleyebilen dahili bir mikrotom ile artırılmış bir tarama elektron mikroskobu yaptığı açıklandı. Ne yazık ki, teknik sınırlamalar, biyolojik doku gibi iletken olmayan numuneler kabul edilemez şarj seviyeleri biriktirdiği için iletken numunelerle kullanımını kısıtladı (doku örneğinde elektron birikmesi)1. Buharlaştırılmış karbon azaltılmış doku şarjı ile kesimler arasındaki blok yüzünü kaplarken, bu büyük ölçüde artan görüntüleme alma süresi ve görüntü depolama, o zamanlar bilgisayar teknolojisi cihaz tarafından oluşturulan büyük dosya boyutlarını yönetmek için yetersiz olduğu için bir sorun olmaya devam etti. Bu metodoloji Denk ve Horstmann tarafından 2004 yılında değişken basınç odası2ile donatılmış bir SBF-SEM kullanılarak yeniden ele alındı. Bu, numune içindeki şarjı azaltan görüntüleme odasına su buharının girmesine izin verdi ve iletken olmayan örneklerin görüntülenmesini görüntü çözünürlüğü kaybına rağmen uygulanabilir hale getirdi. Doku hazırlama ve görüntüleme yöntemlerinde daha fazla iyileştirme artık yüksek vakum kullanılarak görüntülemeye izin verir ve SBF-SEM görüntüleme artık şarj 3 , 4,5,6,7,8,9’udağıtmak için su buharı güvenmez. SBF-SEM’de son yıllarda kullanımda üstel bir artış görülürken, bu görüntüleme modalitesinin başarısı için uygun doku hazırlama ve görüntüleme parametreleri gibi teknik yönler her şeyden önemlidir.

SBF-SEM, 3-5 nm10,11gibi küçük düzlemsel çözünürlüğe sahip binlerce seri kayıtlı elektron mikroskopi görüntülerinin otomatik olarak toplanmasına izin verir. Ağır metallerle emprenye edilen ve reçineye gömülü doku, elmas bıçakla donatılmış bir ultramikrotom içeren bir tarama elektron mikroskobuna (SEM) yerleştirilir. Elmas bıçakla düz bir yüzey kesilir, bıçak geri çekilir ve bloğun yüzeyi, doku ultrayapısının bir görüntüsünü oluşturmak için elektron ışını ile raster desende taranır. Blok daha sonra z ekseninde “z-adım” olarak bilinen belirli bir miktar (örneğin, 100 nm) yükseltilir ve işlem tekrarlanmadan önce yeni bir yüzey kesilir. Bu şekilde doku kesildikçe 3 boyutlu (3D) bir görüntü bloğu üretilir. Bu görüntüleme sistemi, cihazın otomatik doğasından daha fazla yararlanarak, tek bir günde mümkün olan yüzlerce görüntünün otomatik olarak toplanmasıyla, görüntüleme işlemi sırasında mikroskobu başıboş bırakmasını sağlar.

SBF-SEM görüntüleme öncelikle blok yüzün görüntüsünü oluşturmak için geri saçılmış elektronlar kullanırken, görüntüleme işlemi sırasında ikincil elektronlar üretilir12. İkincil elektronlar, bloktan kaçmayan geri saçılmış ve birincil ışınlı elektronların yanı sıra birikebilir ve blok yüzünde lokalize bir elektrostatik alana yol açabilecek “doku şarjı” üretebilir. Bu elektron birikimi görüntüyü bozabilir veya elektronların bloktan atılmasına neden olabilir ve geri teli dedektörü tarafından toplanan sinyale katkıda bulunarak sinyal-gürültü oranını13azaltır. Doku şarj seviyesi elektron ışını voltajı veya yoğunluğu azaltılarak veya ışın durma süresini azaltarak azaltılabilirken, bu sinyal-gürültü oranının azalmasına neden olur14. Daha düşük voltajlı veya yoğunlukta bir elektron ışını kullanıldığında veya kirişin her piksel alanında daha kısa bir süre kalmasına izin verildiğinde, dokudan daha az geri saçılmış elektron atilir ve elektron dedektörü tarafından yakalanır ve daha zayıf bir sinyalle sonuçlanır. Denk ve Horstmann, bu sorunu odaya su buharı sokarak ele aldı, böylece görüntü çözünürlüğü pahasına odadaki ve blok yüzündeki yükü azalttı. 10-100 Pa oda basıncı ile, elektron ışınının bir kısmı görüntü gürültüsüne ve çözünürlük kaybına katkıda bulunan dağınıktır, ancak bu aynı zamanda numune bloğu2içindeki yükü nötralize eden numune odasında iyonlar üretir. Numune bloğu içindeki yükü nötralize etmek için daha yeni yöntemler, görüntüleme sırasında blok yüzü üzerinde azot odak gazı enjeksiyonu veya prob-ışınlı kepçe enerjisini azaltmak ve toplanan sinyali artırmak için SBF-SEM aşamasına negatif voltaj getirmek içinkullanır 6,7,15. Blok yüzeyinde yük birikmesini azaltmak için sahne önyargısı, oda basıncı veya lokalize azot enjeksiyonu getirmek yerine, daha agresif görüntüleme ayarlarına izin vererek reçine karışımına karbon sokarak reçinenin iletkenliğini artırmak da mümkündür16. Aşağıdaki genel protokol, 2010 yılında yayınlanan Deerinck ve ark. protokolünün bir uyarlamasıdır ve yüksek çözünürlüklü görüntü alımını korurken doku şarjını en aza indirmek için yararlı bulduğumuz doku hazırlama ve görüntüleme metodolojilerinde yapılan değişiklikleri kapsar3,17,18,19. Daha önce bahsedilen protokol doku işleme ve ağır metal emprenyesine odaklanırken, bu protokol SBF-SEM çalışmalarının doğasında bulunan görüntüleme, veri analizi ve rekonstrüksiyon iş akışı hakkında fikir vermektedir. Laboratuvarımızda bu protokol kornea ve ön segment yapıları da dahil olmak üzere çok çeşitli dokulara başarıyla ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanmıştır, göz kapağı, lakrimal ve sert bezi, retina ve optik sinir, kalp, akciğer ve hava yolu, böbrek, karaciğer, cremaster kası ve serebral korteks / medulla ve fare, sıçan, tavşan, kobay, balık, monolayer ve tabakalı hücre kültürleri, domuz, insan olmayan primat ve insan20 , 21,22,23dahil olmak üzere çeşitli türlerde. Küçük değişiklikler belirli dokular ve uygulamalar için değerli olsa da, bu genel protokol temel görüntüleme tesisimiz bağlamında son derece tekrarlanabilir ve yararlı olduğunu kanıtlamıştır.

Protocol

Tüm hayvanlar, Görme ve Oftalmik Araştırmalarda Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Houston Üniversitesi Optometri Üniversitesi hayvan işleme yönergelerinde açıklanan yönergelere göre ele alındı. Tüm hayvan prosedürleri ele alındıkları kurumlar tarafından onaylandı: Fare, sıçan, tavşan, kobay ve insan dışı primat prosedürleri Houston Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı, zebra balığı prosedürleri DePauw Üniversit…

Representative Results

Fare KorneasıBu protokol fare korneasına kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. SBF-SEM görüntüleme kullanılarak, yetişkin fare korneası içinde elastin içermeyen mikrofibril demetlerden (EFMB) oluşan bir ağın mevcut olduğu gösterilmiştir. Daha önce bu ağın sadece embriyonik ve erken postnatal gelişim sırasında mevcut olduğuna inanılıyordu. SBF-SEM, kornea boyunca geniş bir EFMB ağı ortaya çıkardı ve kesit şeklinde ölçüldüğünde 100-200 nm çapında olduğu tespi…

Discussion

Bu yöntemlerin amacı, laboratuvarımızın yüksek çözünürlüklü seri elektron mikroskopi görüntülerini güvenilir bir şekilde yakalamasını sağlayan doku hazırlama ve görüntüleme metodolojisini vurgulamak ve SBF-SEM görüntülemesini yaparken oluşabilecek potansiyel tuzakların yanı sıra bu sonuca yol açan kritik adımlara dikkat çekmektir. Bu protokolün kullanılmasındaki başarı, dokunun düzgün bir şekilde sabitlenmesi, ağır metallerin numuneye emprenye edilmesi, şarjı azaltmak için g…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown ve Margaret Gondo’ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 EY-018239 ve P30 EY007551 (Ulusal Göz Enstitüsü), kısmen Lion’s Foundation for Sight ve kısmen NIH 1R15 HD084262-01 (Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü) tarafından desteklendi.

Materials

1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue – Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, &. #. 3. 5. 2. ;., Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid–containing membranes and droplets in osmium tetroxide–fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we–where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscienze. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. . Unbiased Stereology. 2nd edn. , (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. . Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , (1988).
  69. Mouton, P. R. . Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , (2002).

Tags

Keywords: Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM)Heavy Metal StainingResin InfiltrationAutomated Image Capture
check_url/it/62045?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image