Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila
Summary
Apresentamos um protocolo para um ensaio de alimentação de duas opções para moscas. Este ensaio de alimentação é rápido e fácil de executar e é adequado não apenas para pesquisas de laboratório de pequena escala, mas também para telas comportamentais de alto rendimento em moscas.
Abstract
Para selecionar alimentos com valor nutricional, evitando o consumo de agentes nocivos, os animais precisam de um sistema de paladar sofisticado e robusto para avaliar seu ambiente alimentar. A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster,é um organismo modelo geneticamente tratável que é amplamente utilizado para decifrar os fundamentos moleculares, celulares e neurais da preferência alimentar. Para analisar a preferência alimentar da mosca, é necessário um método de alimentação robusto. Descrito aqui é um ensaio de alimentação de duas opções, que é rigoroso, econômico e rápido. O ensaio é à base de placas de Petri e envolve a adição de dois alimentos diferentes complementados com corante azul ou vermelho às duas metades do prato. Em seguida, ~70 prestarved, moscas de 2-4 dias de idade são colocadas no prato e permitidos para escolher entre alimentos azuis e vermelhos no escuro por cerca de 90 minutos. O exame do abdômen de cada mosca é seguido pelo cálculo do índice de preferência. Em contraste com placas multiwell, cada placa de Petri leva apenas ~20 s para encher e economiza tempo e esforço. Este ensaio alimentar pode ser empregado para determinar rapidamente se as moscas gostam ou não de um determinado alimento.
Introduction
Apesar das diferenças dramáticas na estrutura anatômica dos órgãos de paladar entre moscas e mamíferos, as respostas comportamentais das moscas a muitas substâncias tastant são surpreendentemente semelhantes às dos mamíferos. Por exemplo, as moscas preferem açúcar1,2,3,4,5,6,7,8, aminoácidos9,10, e baixo sal11, que indicam nutrientes, mas rejeitam alimentos amargos12,13,14,15 que são inpalatáveis ou tóxicos. Nas últimas duas décadas, as moscas provaram ser um organismo modelo altamente valioso para avançar na compreensão de muitas questões fundamentais relacionadas à sensação do sabor e ao consumo alimentar, incluindo detecção de sabor, transdução de sabor, plasticidade do sabor e regulação alimentar16,17,18,19,20. Notavelmente, uma série de estudos têm demonstrado que os mecanismos de transdução de sabor e circuito neural subjacentes à percepção do sabor são análogos entre moscas frutíferas e mamíferos. Portanto, a mosca-das-frutas serve como um organismo experimental ideal, permitindo que os pesquisadores descubram conceitos e princípios evolutivamente conservados que regem a detecção e o consumo de alimentos no reino animal.
Para investigar a sensação de sabor em moscas, é fundamental estabelecer um ensaio rápido e rigoroso para medir objetivamente a preferência alimentar. Ao longo dos anos, vários métodos de alimentação, tais como ensaios à base de corante11,12,13,21,22,23, o ensaio de resposta de extensão proboscis mosca24, o alimentador capilar (CAFE) ensaio25,26, o ensaio Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)eoutros métodos combinatórios foram desenvolvidos para medir quantitativamente a preferência alimentar e/ou a ingestão alimentar de moscas de frutas28,29,30,31. Um dos paradigmas populares de alimentação é o ensaio de alimentação de duas opções baseado em corante usando uma placa de microtiter multiwell12,21,32 ou, como descrito aqui, uma pequena placa de Petri11,22 como a câmara de alimentação. Este ensaio é projetado com base na transparência do abdômen da mosca. Durante este ensaio, as moscas são colocadas na câmara de alimentação e apresentadas com duas opções de alimentos misturadas com corante vermelho ou corante azul. Uma vez que o ensaio esteja completo, os abdômens de mosca aparecem vermelhos ou azuis, dependendo de qual alimento eles consumiram.
Tanto a placa de Petri quanto os ensaios de alimentação à base de corante de placas multiwell são altamente robustos e produzem aproximadamente os mesmos resultados. Utilizando esses dois ensaios, inúmeras descobertas importantes e avanços foram feitos para decifrar os receptores e células altamente diversificados responsáveis por detectar os gostos alimentares e a textura dos alimentos11,12,21,22,32,33. No ensaio baseado em corante, um passo experimental que requer tempo e esforço considerável é preparar e carregar alimentos na câmara de alimentação. Para reduzir o tempo de preparação e carregamento dos alimentos, este ensaio foi modificado substituindo a placa de microtiter multiwell por uma pequena placa de Petri, que é dividida em dois compartimentos iguais. No ensaio à base de placa de Petri, dois alimentos diferentes complementados com corante azul ou vermelho são adicionados às duas metades do prato. Em seguida, ~70 prestarved, moscas de 2-4 dias de idade são colocadas no prato e permitidos para escolher entre alimentos azuis e vermelhos no escuro por cerca de 90 minutos. O abdômen de cada mosca é então examinado, e o índice de preferência (PI) é calculado.
Este ensaio de alimentação de duas opções baseado em placa de Petri é acessível, simples e rápido. Uma placa multiwell requer aproximadamente 110 s para encher, enquanto cada placa de Petri leva apenas ~20 s. Além disso, a placa multiwell requer a tubulação de pequenos volumes de alimentos em um grande número de pequenos poços (por exemplo, 60 ou mais poços por placa), o que exige considerável precisão e atenção. Por outro lado, o ensaio baseado em placa de Petri requer apenas duas ações por placa. Como o ensaio de alimentação pode envolver um grande número de réplicas, o ensaio baseado em placa de Petri economiza uma quantidade não trivial de tempo e esforço. Este ensaio dá resultados equivalentes aos do ensaio baseado em multiwell e tem se mostrado bem sucedido em abordar muitas questões fundamentais na sensação do sabor, incluindo a codificação do sabor salgado11,a plasticidade do sabor modificada pela experiência alimentar22, e a base molecular da sensação da textura dos alimentos33. Em resumo, este ensaio de duas opções baseado em placa de Petri é uma ferramenta poderosa para investigar como as moscas percebem o meio de nutrientes externos e internos para obter o comportamento alimentar adequado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método envolve várias etapas cruciais onde problemas podem ocorrer. Primeiro, certifique-se de que as moscas ingeram uma quantidade suficiente de alimentos para fornecer dados estáveis. Se as moscas comem mal, certifique-se de que as moscas estão com fome há pelo menos 24 horas, e que a mídia experimental contém pelo menos uma concentração mínima de sacarose (2 mM). Para estimular ainda mais o consumo alimentar, prolongar o período de fome úmida para além das 24 horas, dependendo da condição fisiológ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Tingwei Mi por ajudá-los a otimizar o ensaio de alimentação de duas opções. Eles também gostariam de agradecer Samuel Chan e Wyatt Koolmees por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, com subsídios R03 DC014787 (Y.V.Z.) e R01 DC018592 (Y.V.Z.) e pela Fundação Ambrose Monell.
Materials
| 35 mm Petri dish | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Agarose | Thomas Scientific | C756P56 | |
| Clear adhesive | Fisher Scientific | NC9884114 | |
| Conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Dissection microscope | Amscope | SM-2T-6WB-V331 | |
| FCF Brilliant Blue | Wako Chemical | 3844-45-9 | |
| Fly CO2 anesthesia setup | Genesee Scientfic | 59-114/54-104M | |
| Fly incubator with programmable day/night cycle | Powers Scientific Inc. | IS33SD | |
| Fly lines | |||
| Glass dish (microwave-safe) | |||
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Media storage bottle | Fisher Scientific | 50-192-9998 | |
| Plastic divider cut to fit the dish from a sheet no thicker than 5 mm | |||
| Plastic fly vials | Genesee Scientific | 32-116 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S9378 | |
| Sulforhodamine B | Millipore Sigma | S9012 | |
| Tastant compound of interest | |||
| Vortex mixer | Benchmark Scientific | BV1000 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD05 |
Riferimenti
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