Kardiale Reaktion auf β-adrenerge Stimulation durch Druck-Volumen-Schleifenanalyse bestimmt
Summary
Hier beschreiben wir eine Herzdruck-Volumen-Schleifenanalyse unter steigenden Dosen von intravenös infundiertem Isoproterenol zur Bestimmung der intrinsischen Herzfunktion und der β-adrenergen Reserve bei Mäusen. Für die Druck-Volumen-Schleifenmessungen verwenden wir einen modifizierten Open-Chest-Ansatz, bei dem wir die Beatmung mit positivem endexspiratorischem Druck einbeziehen.
Abstract
Die Bestimmung der Herzfunktion ist eine robuste Endpunktanalyse in Tiermodellen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, um Effekte spezifischer Behandlungen auf das Herz zu charakterisieren. Aufgrund der Machbarkeit genetischer Manipulationen ist die Maus zum häufigsten Säugetiertiermodell geworden, um die Herzfunktion zu untersuchen und nach neuen potenziellen therapeutischen Zielen zu suchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bestimmung der Herzfunktion in vivo unter Verwendung von Druck-Volumen-Schleifenmessungen und -analysen unter basalen Bedingungen und unter β-adrenergen Stimulation durch intravenöse Infusion von steigenden Isoproterenolkonzentrationen. Wir bieten ein verfeinertes Protokoll einschließlich Beatmungsunterstützung unter Berücksichtigung des positiven endexspiratorischen Drucks zur Verbesserung negativer Effekte bei Messungen am offenen Brustkorb und einer starken Analgesie (Buprenorphin), um unkontrollierbaren Myokardstress zu vermeiden, der durch Schmerzen während des Eingriffs hervorgerufen wird. Insgesamt ermöglicht die detaillierte Beschreibung des Verfahrens und die Diskussion über mögliche Fallstricke eine hochstandardisierte und reproduzierbare Druck-Volumen-Schleifenanalyse, die den Ausschluss von Tieren aus der experimentellen Kohorte reduziert, indem mögliche methodische Verzerrungen verhindert werden.
Introduction
Herz-Kreislauf-Erkrankungen beeinflussen typischerweise die Herzfunktion. Diese Frage weist auf die Bedeutung der Beurteilung der detaillierten In-vivo-Herzfunktion in Tierversuchsmodellen hin. Tierversuche sind von einem Rahmen der drei Rs (3Rs) Leitprinzipien (Reduce/Refine/Replace) umgeben. Im Falle des Verständnisses komplexer Pathologien mit systemischen Reaktionen (d.h. Herz-Kreislauf-Erkrankungen) auf der aktuellen Entwicklungsebene besteht die Hauptoption darin, die verfügbaren Methoden zu verfeinern. Die Verfeinerung wird auch zu einer Verringerung der erforderlichen Tierzahlen aufgrund der geringeren Variabilität führen, was die Aussagekraft der Analyse und der Schlussfolgerungen verbessert. Darüber hinaus bietet die Kombination von kardialen Kontraktilitätsmessungen mit Tiermodellen von Herzerkrankungen, einschließlich solcher, die durch neurohumorale Stimulation oder durch Drucküberlastung wie Aortenbanding induziert werden, die beispielsweise veränderte Katecholamin/β-adrenerge Spiegel1,2,3,4nachahmen, eine leistungsfähige Methode für präklinische Studien. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die katheterbasierte Methode nach wie vor der am weitesten verbreitete Ansatz zur eingehenden Beurteilung der kardialen Kontraktilität5ist, wollten wir hier eine verfeinerte Messung der In-vivo-Herzfunktion bei Mäusen durch Druck-Volumen-Schleifen-Messungen (PVL) während der β-adrenergen Stimulation auf der Grundlage früherer Erfahrungen, einschließlich der Bewertung spezifischer Parameter dieses Ansatzes, vorstellen6. ( 7) DIE MITGLIEDSTAATEN SIND IN DEN
Zur Bestimmung kardialer hämodynamischer Parameter stehen Ansätze zur Verfügung, die bildgebende oder katheterbasierte Techniken umfassen. Beide Optionen gehen mit Vor- und Nachteilen einher, die für die jeweilige wissenschaftliche Fragestellung sorgfältig abgewogen werden müssen. Bildgebende Ansätze umfassen Echokardiographie und Magnetresonanztomographie (MRT); beide wurden erfolgreich bei Mäusen eingesetzt. Echokardiographische Messungen sind mit hohen Anschaffungskosten durch eine Hochgeschwindigkeitssonde verbunden, die für die hohe Herzfrequenz der Mäuse erforderlich ist. Es ist ein relativ einfacher nicht-invasiver Ansatz, aber er ist variabel unter den Bedienern, die idealerweise Erfahrung in der Erkennung und Visualisierung von Herzstrukturen haben sollten. Darüber hinaus können keine Druckmessungen direkt durchgeführt werden und Berechnungen werden aus der Kombination von Größengrößen und Durchflussmessungen erhalten. Zum anderen hat es den Vorteil, dass mehrere Messungen am selben Tier durchgeführt werden können und die Herzfunktion beispielsweise während des Krankheitsverlaufs überwacht werden kann. Hinsichtlich der Volumenmessung ist die MRT das Goldstandardverfahren, aber ähnlich wie bei der Echokardiographie sind keine direkten Druckmessungen möglich und es können nur vorlastabhängige Parameter erhalten werden8. Limitierende Faktoren sind auch die Verfügbarkeit, der Analyseaufwand und die Betriebskosten. Hier sind katheterbasierte Methoden zur Messung der Herzfunktion eine gute Alternative, die zusätzlich die direkte Überwachung des intrakardialen Drucks und die Bestimmung lastunabhängiger Kontraktilitätsparameter wie preload recruitable stroke work (PRSW)9ermöglichen. Die ventrikulären Volumina, die mit einem Druckleitfähigkeitskatheter (durch Leitfähigkeitsbestimmung) gemessen werden, sind jedoch kleiner als die aus dem MRT, aber die Gruppenunterschiede werden im gleichen Bereich beibehalten10. Um zuverlässige Volumenwerte zu ermitteln, ist die entsprechende Kalibrierung erforderlich, die ein kritischer Schritt bei den PVL-Messungen ist. Es kombiniert ex vivo Messungen der Blutleitfähigkeit in volumenkalibrierten Küvetten (Umwandlung von Leitfähigkeit in Volumen) mit der in vivo Analyse für die Parallelleitung des Myokards während der Bolusinjektion der hypertonen Kochsalzlösung11,12. Darüber hinaus sind die Positionierung des Katheters im Ventrikel und die korrekte Ausrichtung der Elektroden entlang der Längsachse des Ventrikels entscheidend für die Nachweisbarkeit des von ihnen erzeugten umgebenden elektrischen Feldes. Mit der reduzierten Größe des Mausherzens ist es möglich, Artefakte zu vermeiden, die durch Veränderungen der intraventrikulären Ausrichtung des Katheters verursacht werden, selbst in erweiterten Ventrikeln5,10, aber Artefakte können sich unter β-adrenerger Stimulationentwickeln 6,13. Zusätzlich zu den Leitwertmethoden schien die Entwicklung der zulassungsbasierten Methode die Kalibrierschritte zu vermeiden, aber hier werden die Volumenwerte eher überschätzt14,15.
Da die Maus eines der wichtigsten präklinischen Modelle in der kardiovaskulären Forschung ist und die β–adrenerge Reserve des Herzens von zentralem Interesse in der Herzphysiologie und -pathologie ist, stellen wir hier ein verfeinertes Protokoll zur Bestimmung der in vivo Herzfunktion bei Mäusen durch PVL-Messungen während β-adrenerger Stimulation vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der in vivo Herzfunktion bei Mäusen unter zunehmender β-adrenerger Stimulation zur Verfügung. Das Verfahren kann verwendet werden, um sowohl Die Basisparameter der Herzfunktion als auch die adrenerge Reserve (z. B. Inotropie und Chronotropie) bei genetisch veränderten Mäusen oder bei Eingriffen zu adressieren. Der wichtigste Vorteil von PVL-Messungen (Pressure-Volume Loop) im Vergleich zu anderen Mitteln zur Bestimmung der Herzfunktion ist die Analyse der intrinsischen, las…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter und dem Team der Interfakultären Biomedizinischen Forschungseinrichtung (IBF) der Universität Heidelberg für die kompetente technische Unterstützung.
Unterstützt wurde diese Arbeit vom DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung), dem BMBF (Bundesministerium für Bildung und Forschung), einem baden-württembergischen Landesinnovationsfonds und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Projekt-ID 239283807 – TRR 152, FOR 2289 und dem Sonderforschungsbereich (SFB) 1118.
Materials
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
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