Risposta cardiaca alla stimolazione β-adrenergica determinata dall'analisi del ciclo pressione-volume
Summary
Qui descriviamo un’analisi del ciclo pressione-volume cardiaco sotto dosi crescenti di isoproterenolo infuso per via endovenosa per determinare la funzione cardiaca intrinseca e la riserva β-adrenergica nei topi. Utilizziamo un approccio a cassa aperta modificato per le misurazioni del ciclo pressione-volume, in cui includiamo la ventilazione con pressione positiva di fine espirazione.
Abstract
La determinazione della funzione cardiaca è una robusta analisi endpoint in modelli animali di malattie cardiovascolari al fine di caratterizzare gli effetti di trattamenti specifici sul cuore. A causa della fattibilità delle manipolazioni genetiche, il topo è diventato il modello animale di mammifero più comune per studiare la funzione cardiaca e cercare nuovi potenziali bersagli terapeutici. Qui descriviamo un protocollo per determinare la funzione cardiaca in vivo utilizzando misurazioni e analisi del ciclo pressione-volume durante le condizioni basali e sotto stimolazione β-adrenergica mediante infusione endovenosa di concentrazioni crescenti di isoproterenolo. Forniamo un protocollo raffinato che include il supporto di ventilazione tenendo conto della pressione positiva di fine espirazione per migliorare gli effetti negativi durante le misurazioni a torace aperto e una potente analgesia (Buprenorfina) per evitare stress miocardico incontrollabile evocato dal dolore durante la procedura. Nel complesso, la descrizione dettagliata della procedura e la discussione sulle possibili insidie consentono un’analisi del ciclo pressione-volume altamente standardizzata e riproducibile, riducendo l’esclusione degli animali dalla coorte sperimentale prevenendo possibili pregiudizi metodologici.
Introduction
Le malattie cardiovascolari in genere influenzano la funzione cardiaca. Questo numero sottolinea l’importanza di valutare in vivo la funzione cardiaca dettagliata nei modelli di malattie animali. La sperimentazione animale è circondata da una cornice dei tre principi guida rs (3R) (Riduci/ Raffina / Sostituisci). In caso di comprensione di patologie complesse che coinvolgono risposte sistemiche (cioè malattie cardiovascolari) all’attuale livello di sviluppo, l’opzione principale è quella di perfezionare i metodi disponibili. La raffinazione porterà anche a una riduzione del numero di animali richiesto a causa della minore variabilità, il che migliora la potenza dell’analisi e delle conclusioni. Inoltre, la combinazione di misurazioni della contrattilità cardiaca con modelli animali di malattie cardiache comprese quelle indotte dalla stimolazione neuroumorale o dal sovraccarico di pressione come il banding aortico, che imita ad esempio i livelli alterati di catecolamina / β-adrenergici1,2,3,4, fornisce un metodo potente per gli studi pre-clinici. Tenendo conto che il metodo basato su catetere rimane l’approccio più utilizzato per la valutazione approfondita della contrattilità cardiaca5, abbiamo mirato a presentare qui una misurazione raffinata della funzione cardiaca in vivo nei topi mediante misurazioni del ciclo pressione-volume (PVL) durante la stimolazione β-adrenergica basata su precedenti esperienze, inclusa la valutazione di parametri specifici di questo approccio6, 7.
Per determinare i parametri emodinamici cardiaci sono disponibili approcci che includono tecniche di imaging o basate su catetere. Entrambe le opzioni sono accompagnate da vantaggi e svantaggi che devono essere attentamente considerati per la rispettiva domanda scientifica. Gli approcci di imaging includono l’ecocardiografia e la risonanza magnetica (MRI); entrambi sono stati utilizzati con successo nei topi. Le misurazioni ecocardiografiche comportano elevati costi iniziali da una sonda ad alta velocità necessaria per l’alta frequenza cardiaca dei topi; è un approccio non invasivo relativamente semplice, ma è variabile tra gli operatori che idealmente dovrebbero essere esperti nel riconoscere e visualizzare le strutture cardiache. Inoltre, non è possibile eseguire direttamente misurazioni della pressione e i calcoli sono ottenuti dalla combinazione di grandezze dimensionali e misurazioni del flusso. D’altra parte, ha il vantaggio che diverse misurazioni possono essere eseguite sullo stesso animale e la funzione cardiaca può essere monitorata ad esempio durante la progressione della malattia. Per quanto riguarda la misurazione del volume, la risonanza magnetica è la procedura gold standard, ma simile all’ecocardiografia, non sono possibili misurazioni dirette della pressione e si possono ottenere solo parametri dipendenti dal precarico8. Fattori limitanti sono anche la disponibilità, lo sforzo di analisi e i costi operativi. Qui i metodi basati su catetere per misurare la funzione cardiaca sono una buona alternativa che consente inoltre il monitoraggio diretto della pressione intracardiaca e la determinazione di parametri di contrattilità indipendenti dal carico come il lavoro di ictus reclutabile precarico (PRSW)9. Tuttavia, i volumi ventricolari misurati da un catetere di pressione-conduttanza (attraverso la determinazione della conducibilità) sono inferiori a quelli della risonanza magnetica, ma le differenze di gruppo sono mantenute nello stesso intervallo10. Per determinare valori di volume affidabili è necessaria la calibrazione corrispondente, che è un passaggio critico durante le misurazioni PVL. Combina misure ex vivo della conducibilità del sangue in cuvette calibrate in volume (conversione della conduttanza in volume) con l’analisi in vivo per la conduttanza parallela del miocardio durante l’iniezione in bolo della soluzione salina ipertonica11,12. Oltre a ciò, il posizionamento del catetere all’interno del ventricolo e il corretto orientamento degli elettrodi lungo l’asse longitudinale del ventricolo sono fondamentali per la capacità di rilevamento del campo elettrico circostante prodotto da loro. Ancora con le ridotte dimensioni del cuore di topo è possibile evitare artefatti prodotti da cambiamenti nell’orientamento intraventricolare del catetere, anche nei ventricoli dilatati5,10,ma gli artefatti possono evolvere sotto stimolazione β-adrenergica6,13. Oltre ai metodi di conduttanza, lo sviluppo del metodo basato sull’ammissione sembrava evitare le fasi di calibrazione, ma qui i valori di volume sono piuttosto sovrastimati14,15.
Poiché il topo è uno dei modelli pre-clinici più importanti nella ricerca cardiovascolare e la β–riserva adrenergica del cuore è di interesse centrale nella fisiologia e patologia cardiaca, presentiamo qui un protocollo raffinato per determinare la funzione cardiaca in vivo nei topi mediante misurazioni PVL durante la stimolazione β-adrenergica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, forniamo un protocollo per analizzare la funzione cardiaca in vivo nei topi sotto stimolazione β-adrenergica crescente. La procedura può essere utilizzata per affrontare sia i parametri basali della funzione cardiaca che la riserva adrenergica (ad esempio, inotropia e cronotropia) nei topi geneticamente modificati o su interventi. Il vantaggio più importante delle misurazioni del ciclo pressione-volume (PVL) rispetto ad altri mezzi per determinare la funzione cardiaca è l’analisi della funzione cardiaca intrinse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Manuela Ritzal, Hans-Peter Gensheimer, Christin Richter e al team dell’Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) dell’Università di Heidelberg per l’assistenza tecnica esperta.
Questo lavoro è stato sostenuto dal DZHK (Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare), dal BMBF (Ministero tedesco dell’istruzione e della ricerca), da un fondo federale per l’innovazione del Baden-Württemberg e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) Project-ID 239283807 – TRR 152, FOR 2289 e dal Collaborative Research Center (SFB) 1118.
Materials
| 1.4F SPR-839 catheter | Millar Instruments, USA | 840-8111 | |
| 1 ml syringes | Beckton Dickinson, USA | REF303172 | |
| Bio Amplifier | ADInstruments, USA | FE231 | |
| Bridge-Amplifier | ADInstruments, USA | FE221 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth, Germany | 8076.2 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Bayer, Germany | 4007221026402 | |
| Calibration cuvette | Millar, USA | 910-1049 | |
| Differential pressure transducer MPX | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 39912 | |
| Dumont Forceps #5/45 | Fine Science tools Inc. | 11251-35 | |
| Dumont Forceps #7B | Fine Science tools Inc. | 11270-20 | |
| Graefe Forceps | Fine Science tools Inc. | 11051-10 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Ver. 8.3.0 | |
| EcoLab-PE-Micotube | Smiths, USA | 004/310/168-1 | |
| Etomidate Lipuro | Braun, Germany | 2064006 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Heparin | Ratiopharm, Germany | R26881 | |
| Hot plate and control unit | Labotec, Germany | Hot Plate 062 | |
| Isofluran | Baxter, Germany | HDG9623 | |
| Isofluran Vaporizer | Abbot | Vapor 19.3 | |
| Isoprenalinhydrochloride | Sigma-Aldrich, USA | I5627 | |
| Fine Bore Polythene tubing 0.61 mm OD, 0.28 mm ID | Smiths Medical International Ltd, UK | Ref. 800/100/100 | |
| MiniVent ventilator for mice | Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, Germany | Type 845 | |
| MPVS Ultra PVL System | Millar Instruments, USA | ||
| NaCl | AppliChem, Germany | A3597 | |
| NaCl 0.9% isotonic | Braun, Germany | 2350748 | |
| Pancuronium-bromide | Sigma-Aldrich, USA | BCBQ8230V | |
| Perfusor 11 Plus | Harvard Apparatus | Nr. 70-2209 | |
| Powerlab 4/35 control unit | ADInstruments, USA | PL3504 | |
| Rechargeable cautery-Set | Faromed, Germany | 09-605 | |
| Scissors | Fine Science tools Inc. | 140094-11 | |
| Software LabChart 7 Pro | ADInstruments, USA | LabChart 7.3 Pro | |
| Standard mouse food | LASvendi GmbH, Germany | Rod18 | |
| Stereo microscope | Zeiss, Germany | Stemi 508 | |
| Surgical suture 8/0 | Suprama, Germany | Ch.B.03120X | |
| Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge | Beckton Dickinson, USA | 393224 | |
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science tools Inc. | 00574-11 | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| Syringe filter (Filtropur S 0.45) | Sarstedt, Germany | Ref. 83.1826 |
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