Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering
Summary
Her beskriver vi en simpel metode, der kombinerer RNA-fluorescens in situ-hybridisering (RNA-FISH) med immunfluorescens for at visualisere svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Denne protokol kan øge forståelsen af de molekylære egenskaber ved SARS-CoV-2 RNA-værtsinteraktioner på et enkeltcellet niveau.
Abstract
Dette manuskript giver en protokol for in situ hybridisering kædereaktion (HCR) kombineret med immunfluorescens at visualisere svær akut luftvejssyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA i celle linje og tre-dimensionelle (3D) kulturer af menneskelige luftveje epitel. Metoden tillader meget specifik og følsom visualisering af viral RNA ved at stole på HCR indledt af sonde lokalisering. Split-initiator sonder hjælpe med at forstærke signalet ved fluorescerende mærkede forstærkere, hvilket resulterer i ubetydelig baggrund fluorescens i konfokal mikroskopi. Mærkning af forstærkere med forskellige lysstofrør letter samtidig anerkendelse af forskellige mål. Dette gør det igen muligt at kortlægge infektionen i væv for bedre at forstå viral patogenese og replikation på enkeltcelleniveau. Kobling af denne metode med immunfluorescens kan gøre det lettere at forstå værtsvirusinteraktioner, herunder vekslen mellem værtseprægenom og immunresponsveje. På grund af følsom og specifik HCR-teknologi kan denne protokol også bruges som et diagnostisk værktøj. Det er også vigtigt at huske, at teknikken let kan ændres for at muliggøre påvisning af RNA, herunder ikke-kodende RNA’er og RNA-vira, der kan opstå i fremtiden.
Introduction
SARS-CoV-2 er en ny human betacoronavirus, der opstod i slutningen af 2019, hvilket forårsagede en hidtil uset pandemi et par måneder senere. Fordi virussen er ny i videnskaben, forbliver meget af dens biologi og dens indvirkning på værtsceller ukendt. Derfor er kortlægning af viruscelle- og vævstropismen under infektion vigtig, hvis dens grundlæggende biologiske egenskaber og dens virkninger på værten skal forstås. Flere teknikker bruges til at undersøge virus-host samspil, herunder biokemiske, biologiske og fysiske assays. In situ hybridisering er en almindelig metode, der anvender mærket komplementær DNA, RNA eller modificerede nukleinsyresonder, som lokaliseres til specifikke DNA- eller RNA-sekvenser i en celle eller et væv.
Der er udviklet en ny RNA-fluorescerende in situ-hybridiseringsmetode (RNA-FISH), som indeholder ændringer for at øge følsomheden ved at forstærke signal-til-støj-forholdet via en HCR1. HCR gør det muligt at studere RNA-lokalisering på et enkeltcelleniveau. På grund af dens høje specificitet, følsomhed og opløsning er denne metode nyttig ikke kun til grundlæggende videnskabelige undersøgelser, men også til anvendelsesprojekter, f.eks. For nylig blev gennemførligheden af denne metode påvist til påvisning af SARS-CoV-2 RNA lokaliseret til ciliated celler inden for fuldt differentierede 3D human luftveje epitel (HAE) kulturer2. HAE kulturer udgør en af de mest avancerede værktøjer, der anvendes til at studere virusinfektion i forbindelse med den “naturlige infektion” mikromiljø3,4.
Flere rapporter om humane coronavirus (HCoV), herunder SARS-CoV-2, fremhæver betydningen af epigenetiske modifikationer med hensyn til HCoV-infektion og patofysiologi [gennemgået i 5],f.eks. Interessant nok identificerede massespektrometrisk screening flere epigenetiske faktorer, der interagerer med SARS-CoV-2 proteome8. Mere specifikt binder nonstructural protein 5 (NSP5) sig til den epigenetiske regulator, histone deacetylase 2 og den katalytisk inaktive NSP5 (C145A) interagerer med tRNA methyltransferase 1 (24). Derudover er NSP16 methyltransferase aktivitet blokeret af methyltransferase hæmmer, sinefungin9. Den nøjagtige rolle, som disse epigenetiske faktorer spiller i COVID-19, er dog fortsat uklar. Replikering af HCoV finder sted i cytoplasmaet i den inficerede celle og udløser inflammatoriske reaktioner, der er reguleret af epigenetiske modifikationer10.
For eksempel, HCoV-229E finjustere nukleare faktor-kappa B signalering og dybt omprogrammerer værten cellulære chromatin landskab ved at øge acetylering af H3K36 og H4K5 i visse regioner11. Den mellemøstlige respiratorisk syndrom-relaterede coronavirus infektion øger niveauet af H3K27me3 og nedbryder H3K4me3 på initiativtageren regioner af delmængder af specifikke interferon-følsomme gener12. Derudover udløser viral RNA celle immunrespons, som det demonstreres for flavivirus13, retrovirus14,15og coronavirus16. De epigenetiske markører på viral RNA kan spille en rolle i anerkendelse af cellulære sensorer, som vist for m7A-methylering af human immundefektvirus-1 RNA17. Men der er stadig spørgsmål: Hvad er virkningen af SARS-CoV-2 RNA på immunresponset, og er epigenetiske mærker involveret?
Her er der beskrevet en optimeret RNA-FISH-metode kombineret med immunfluorescensanalyse af cellelinjer og 3D-væv (fuldt differentieret HAE). Selv om cytologiske metoder, såsom FISH og immunfluorescens, anvendes bredt, har denne nye generation af in situ-hybridiseringsmetode baseret på HCR aldrig været anvendt til virusdetektion (undtagen i en nylig publikation)2. Generelt kræver immunostaining og FISH følgende trin: gennemtrængning for at muliggøre indtrængen af sonder eller antistoffer; fiksering, hvori cellulært materiale er fastgjort og konserveret påvisning, hvori der anvendes antistoffer eller nukleinsyresonder og endelig montering af prøverne til visualisering.
Selv om de eksisterende protokoller deler disse generelle træk, varierer de markant med hensyn til de involverede parametre. Her er en optimeret, enkel, immuno-RNA-FISH-protokol blevet beskrevet for at detektere SARS-CoV-2 RNA i HAE kulturer og Vero celler. Teknikken omfatter følgende trin: 1) fiksering af celler med paraformaldehyd; 2) permebilisering med vaske- og rengøringsmidler eller methanol (MeOH) 3) rehydrering gennem en gradueret serie af MeOH-opløsninger (kun HAE-kulturer) 4) påvisning 5) forstærkning ved hjælp af HCR-teknologi til påvisning af SARS-CoV-2 RNA 6) immunosang og (7) billeddannelse under et konfokalt mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH er en pålidelig metode til dobbelt farvning af RNA og cellulære proteiner. Her er der beskrevet en modificeret immuno-RNA-FISH-protokol, der gør det muligt at detektere SARS-CoV-2 RNA og cellulære proteiner i cellelinjer og HAE-kulturer. Denne protokol kan tilpasses til brug i forskellige cellemodeller, herunder cellemonomerer eller specifikke væv. Metoden bygger på begrebet en HCR indledt af passende sonde lokalisering. Dernæst resulterer brugen af split-initiator sonder til at begynde forstærkni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse for forskning i SARS-CoV-2 og af tilskud fra National Science Center (tilskud UMO2017/27/B/NZ6/02488 til K.P. og UMO-2018/30/E/NZ1/00874 til A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
Riferimenti
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
