सीटू संकरण में इम्यूनो आरएनए-फ्लोरेसेंस का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का दृश्य
Summary
यहां, हम एक सरल विधि का वर्णन करते हैं जो गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) आरएनए की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ सीटू संकरण (आरएनए-फिश) में आरएनए फ्लोरेसेंस को जोड़ती है। यह प्रोटोकॉल एक एकल-सेल स्तर पर सार्स-सीओवी-2 आरएनए-होस्ट इंटरैक्शन की आणविक विशेषताओं की समझ बढ़ा सकता है।
Abstract
यह पांडुलिपि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) सेल लाइन में आरएनए और मानव वायुमार्ग एपिथेलियम की त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृतियों की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ मिलकर एक प्रोटोकॉल प्रदान करती है। विधि जांच स्थानीयकरण द्वारा शुरू किए गए एचसीआर पर भरोसा करके वायरल आरएनए के अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील दृश्य की अनुमति देती है। स्प्लिट-सर्जक जांच फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एम्पलीफायरों द्वारा सिग्नल को बढ़ाने में मदद करती है, जिसके परिणामस्वरूप कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में नगण्य पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस होता है। विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबलिंग एम्पलीफायर विभिन्न लक्ष्यों की एक साथ मान्यता की सुविधा प्रदान करता है। यह, बदले में, ऊतकों में संक्रमण के मानचित्रण को एकल कोशिका स्तर पर वायरल रोगजनन और प्रतिकृति को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ इस विधि को युग्मन करने से मेजबान-वायरस इंटरैक्शन की बेहतर समझ की सुविधा हो सकती है, जिसमें मेजबान एपिजेनोम और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मार्गों का परिवर्तन शामिल है। संवेदनशील और विशिष्ट एचसीआर तकनीक के कारण, इस प्रोटोकॉल का उपयोग नैदानिक उपकरण के रूप में भी किया जा सकता है। यह भी याद रखना महत्वपूर्ण है कि तकनीक को आसानी से संशोधित किया जा सकता है ताकि भविष्य में उभरने वाले गैर-कोडिंग आरएनए और आरएनए वायरस सहित किसी भी आरएनए का पता लगाया जा सके ।
Introduction
सार्स-सीओवी-2 एक उपन्यास मानव बीटाकोरोनेवस है जो 2019 के अंत में उभरा, जिससे कुछ महीनों बाद अभूतपूर्व महामारी पैदा हुई। क्योंकि वायरस विज्ञान के लिए नया है, अपने जीव विज्ञान के बहुत और मेजबान कोशिकाओं पर इसके प्रभाव अज्ञात रहते हैं । इसलिए, संक्रमण के दौरान वायरस-सेल और -ऊतक ट्रॉपिज्म का मानचित्रण महत्वपूर्ण है यदि इसकी बुनियादी जैविक विशेषताओं और मेजबान पर इसके प्रभाव को समझना होगा। जैव रासायनिक, जैविक और शारीरिक परख सहित वायरस-होस्ट परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। सीटू संकरण में एक आम तरीका है जो पूरक डीएनए, आरएनए, या संशोधित न्यूक्लिक एसिड जांच को नियोजित करता है, जो कोशिका या ऊतक में विशिष्ट डीएनए या आरएनए दृश्यों के लिए स्थानीयकरण करता है।
सीटू संकरण (आरएनए-फिश) विधि में एक नया आरएनए फ्लोरोसेंट विकसित किया गया है जिसमें एचसीआर1के माध्यम से सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाकर संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए संशोधनों को शामिल किया गया है। एचसीआर एकल-कोशिका स्तर पर आरएनए स्थानीयकरण के अध्ययन की अनुमति देता है। इसकी उच्च विशिष्टता, संवेदनशीलता और संकल्प के कारण, यह विधि न केवल बुनियादी विज्ञान अध्ययनों के लिए, बल्कि लागू परियोजनाओं, जैसे निदान के लिए भी उपयोगी है। हाल ही में, इस विधि की व्यवहार्यता को पूरी तरह से विभेदित 3 डी मानव वायुमार्ग एपिथेलियम (एचएई) संस्कृतियों2 के भीतर सिलिएटेड कोशिकाओं के लिए स्थानीय सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने के लिए प्रदर्शित किया गया था। एचएई संस्कृतियां “प्राकृतिक संक्रमण” माइक्रोएनवायरमेंट3,4के संदर्भ में वायरल संक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे उन्नत उपकरणों में से एक है।
सार्स-सीओवी-2 सहित मानव कोरोनावायरस (एचकोवी) पर कई रिपोर्टें, एचकोवी संक्रमण और रोगविज्ञान के संबंध में एपिजेनेटिक संशोधनों के महत्व को उजागर करती हैं [5में समीक्षा की गई], उदाहरण के लिए, जीन का मिथाइलेशन पैटर्न एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एसीई-2) रिसेप्टर6,7। दिलचस्प बात यह है कि मास-स्पेक्ट्रोमेट्रिक स्क्रीनिंग ने कई एपिजेनेटिक कारकों की पहचान की जो सार्स-सीओवी-2 प्रोटेम 8 के साथ बातचीतकरतेहैं । अधिक विशेष रूप से, गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 5 (एनएसपी 5) एपिजेनेटिक नियामक, हिस्टोन डीसेटाइलेज 2 से बांधता है, और उत्प्रेरक रूप से निष्क्रिय एनएसपी5 (C145A) tRNA मिथाइलट्रांसफरेज 1 (24) के साथ बातचीत करता है। इसके अतिरिक्त, एनएसपी16 मिथाइलट्रांसफेरेज गतिविधि को मिथाइलट्रांसफेरेज अवरोधक, सिनेफुंगिन 9 द्वारा अवरुद्ध कियाजाताहै। हालांकि, COVID-19 में इन एपीजेनेटिक कारकों की सही भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है । एचकोवी की प्रतिकृति संक्रमित कोशिका के साइटोप्लाज्म में होती है, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करती है जो एपिजेनेटिक संशोधनों द्वारा विनियमित होती हैं10।
उदाहरण के लिए, HCoV-229E ठीक धुनों परमाणु कारक-कापा बी संकेत और गहराई से कुछ क्षेत्रों में H3K36 और H4K5 के एसीटिलेशन में वृद्धि करके मेजबान सेलुलर क्रोमेटिन परिदृश्य reprograms11। मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम से संबंधित कोरोनावायरस संक्रमण H3K27me3 के स्तर को बढ़ाता है और विशिष्ट इंटरफेरॉन-संवेदनशील जीन12के सबसेट के प्रमोटर क्षेत्रों में H3K4me3 को कम करता है । इसके अतिरिक्त, वायरल आरएनए सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है, जैसा कि फ्लेविवायरस13,रेट्रोवायरस14, 15और कोरोनावायरस16के लिए प्रदर्शित किया गया है। वायरल आरएनए पर एपिजेनेटिक मार्कर सेलुलर सेंसर द्वारा मान्यता में भूमिका निभा सकते हैं, जैसा कि मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस-1 आरएनए17के m7A मिथाइलेशन के लिए दिखाया गया है। हालांकि, सवाल रहते हैं: प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर सार्स-CoV-2 आरएनए का क्या प्रभाव है, और एपीजेनेटिक मार्क्स शामिल हैं?
यहां, सेल लाइनों और 3 डी ऊतकों (पूरी तरह से विभेदित HAE) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के साथ मिलकर एक अनुकूलित आरएनए-मछली विधि का वर्णन किया गया है। यद्यपि मछली और इम्यूनोफ्लोरेसेंस जैसे साइटोलॉजिकल तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, एचसीआर पर आधारित सीटू संकरण विधि में इस नई पीढ़ी का उपयोग वायरस का पता लगाने (हाल ही में प्रकाशन को छोड़कर) 2 के लिएकभीनहीं किया गया है। सामान्य तौर पर, इम्यूनोदाता और मछली को निम्नलिखित चरणों की आवश्यकता होती है: जांच या एंटीबॉडी के प्रवेश को सक्षम करने के लिए पारमेबिलाइजेशन; निर्धारण जिसमें सेलुलर सामग्री को ठीक किया जाता है और संरक्षित किया जाता है; पता लगाना जिसमें एंटीबॉडी या न्यूक्लिक एसिड जांच लागू की जाती है; और अंत में, दृश्य के लिए नमूनों की बढ़ती।
हालांकि मौजूदा प्रोटोकॉल इन सामान्य सुविधाओं को साझा करते हैं, वे शामिल मापदंडों के संबंध में स्पष्ट रूप से भिन्न होते हैं। यहां, एचएई संस्कृतियों और वेरो कोशिकाओं में सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने के लिए एक अनुकूलित, सरल, इम्यूनो-आरएनए-फिश प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तकनीक में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: (1) पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं का निर्धारण; (2) डिटर्जेंट या मेथनॉल (MeOH) के साथ पारमेबिलाइजेशन; (3) MeOH समाधान (केवल HAE संस्कृतियों) की एक वर्गीकृत श्रृंखला के माध्यम से रिहाइड्रेशन; (4) पता लगाना; (5) सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने के लिए एचसीआर प्रौद्योगिकी का उपयोग करके प्रवर्धन; (6) इम्यूनोदाता; और (7) एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे इमेजिंग।
Protocol
Representative Results
Discussion
इम्यूनो-आरएनए-फिश आरएनए और सेलुलर प्रोटीन के डबल-स्टेनिंग के लिए एक विश्वसनीय तरीका है। यहां, एक संशोधित इम्यूनो-आरएनए-फिश प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है जो कोशिका लाइनों और एचएई संस्कृतियों में सार्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सार्स-CoV-2 पर अनुसंधान के लिए विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, और राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान UMO2017/27/B/NZ6/02488 के लिए K.P. और UMO-2018/30/E/NZ1/00874 से एके-पी. को अनुदान) ।
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
Riferimenti
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
