Visualisering av SARS-CoV-2 med immun RNA-fluorescens i Situ hybridisering
Summary
Här beskriver vi en enkel metod som kombinerar RNA fluorescens in situ hybridisering (RNA-FISH) med immunofluorescens för att visualisera allvarliga akut respiratoriska syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Detta protokoll kan öka förståelsen för de molekylära egenskaperna hos SARS-CoV-2 RNA-värd interaktioner på en cell nivå.
Abstract
Detta manuskript ger ett protokoll för in situ hybridiseringskedja reaktion (HCR) i kombination med immunofluorescens för att visualisera allvarliga akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA i cellinjen och tredimensionella (3D) kulturer av mänskliga luftvägarna epitel. Metoden möjliggör mycket specifik och känslig visualisering av viralt RNA genom att förlita sig på HCR initierad av sondlokalisering. Split-initiator sonder hjälper till att förstärka signalen av fluorescerande märkta förstärkare, vilket resulterar i försumbar bakgrund fluorescens i konfokal mikroskopi. Märkning av förstärkare med olika fluorescerande färgämnen underlättar samtidig igenkänning av olika mål. Detta gör det i sin tur möjligt att kartlägga infektionen i vävnader för att bättre förstå viral patogenes och replikering på encellsnivå. Koppling av denna metod med immunofluorescens kan underlätta bättre förståelse för värd-virus interaktioner, inklusive växling av värd epigenom och immunsvar vägar. På grund av känslig och specifik HCR-teknik kan detta protokoll också användas som ett diagnostiskt verktyg. Det är också viktigt att komma ihåg att tekniken lätt kan modifieras för att möjliggöra upptäckt av alla RNA, inklusive icke-kodande RNAs och RNA-virus som kan uppstå i framtiden.
Introduction
SARS-CoV-2 är ett nytt humant betacoronavirus som uppstod i slutet av 2019 och orsakade en aldrig tidigare skådad pandemi några månader senare. Eftersom viruset är nytt för vetenskapen är mycket av dess biologi och dess inverkan på värdceller fortfarande okänd. Därför är kartläggning av viruscells- och vävnadstropismen under infektion viktig om dess grundläggande biologiska egenskaper och dess effekter på värden ska förstås. Flera tekniker används för att undersöka virus-värd samspel inklusive biokemiska, biologiska och fysiska analyser. In situ hybridisering är en vanlig metod som använder märkt kompletterande DNA, RNA eller modifierade nukleinsyra sonder, som lokaliserar till specifika DNA eller RNA sekvenser i en cell eller vävnad.
En ny RNA fluorescerande in situ hybridisering (RNA-FISH) metod har utvecklats som innehåller modifieringar för att öka känsligheten genom att förstärka signal-till-brus förhållandet via en HCR1. HCR möjliggör studier av RNA-lokalisering på en encellig nivå. På grund av dess höga specificitet, känslighet och upplösning är denna metod användbar inte bara för grundläggande vetenskapsstudier, utan också för applikatoriska projekt, t.ex. diagnostik. Nyligen visades genomförbarheten av denna metod för att upptäcka SARS-CoV-2 RNA lokaliseras till ciliated celler inom helt differentierade 3D mänskliga luftvägarna epitel (HAE) kulturer2. HAE kulturer utgör ett av de mest avancerade verktygen som används för att studera virusinfektion i samband med mikromiljön “naturlig infektion”3,4.
Flera rapporter om mänskliga coronavirus (HCoV), inklusive SARS-CoV-2, belyser vikten av epigenetiska modifieringar med avseende på HCoV-infektion och patofysiologi [granskas i 5], t.ex. metyleringsmönstret för genen som kodar för det angiotensinkonverterande enzymet 2 (ACE-2) receptor6,7. Intressant nog identifierade masspektrometrisk screening flera epigenetiska faktorer som interagerar med SARS-CoV-2 proteome8. Mer specifikt binder nonstructural protein 5 (NSP5) till den epigenetiska regulatorn, histondeacetylas 2 och katalytiskt inaktiva NSP5 (C145A) interagerar med tRNA metyltransferas 1 (24). Dessutom blockeras NSP16 metyltransferasaktivitet av metyltransferashämmaren, sinefungin9. Den exakta rollen för dessa epigenetiska faktorer i COVID-19 är dock fortfarande oklar. Replikering av HCoV sker i cytoplasman i den infekterade cellen och utlöser inflammatoriska svar som regleras av epigenetiska modifieringar10.
Till exempel, HCoV-229E finjustera kärnfaktor-kappa B signalering och djupgående omprogrammera värd cellulära kromatin landskap genom att öka acetylering av H3K36 och H4K5 i vissa regioner11. Mellanöstern respiratoriska syndrom-relaterade coronavirus infektion ökar nivåerna av H3K27me3 och utarmar H3K4me3 vid promotorn regioner i delmängder av specifika interferon-känsliga gener12. Dessutom utlöser viralt RNA cellimmunsvar, vilket visas för flavivirus13,retrovirus14,15och coronavirus16. Epigenetiska markörer på viralt RNA kan spela en roll i erkännande av cellulära sensorer, som visas för m7A metylering av humant immunbristvirus-1 RNA17. Frågor kvarstår dock: Vad är effekten av SARS-CoV-2 RNA på immunsvaret, och är epigenetiska märken inblandade?
Här har en optimerad RNA-FISH-metod i kombination med immunofluorescensanalys av cellinjer och 3D-vävnader (helt differentierad HAE) beskrivits. Även om cytologiska metoder, såsom FISH och immunofluorescens, används i stor utsträckning, har denna nya generation in situ hybridiseringsmetod baserad på HCR aldrig använts för virusdetektering (förutom i en ny publikation)2. I allmänhet kräver immunostaining och FISH följande steg: permeabilisering för att möjliggöra penetration av sonder eller antikroppar; Fixering där cellmaterial är fixerat och konserverat. Detektion där antikroppar eller nukleinsyrasonder appliceras. och slutligen montering av proverna för visualisering.
Även om befintliga protokoll delar dessa allmänna funktioner varierar de markant med avseende på de parametrar som är inblandade. Här har ett optimerat, enkelt, immuno-RNA-FISH-protokoll beskrivits för att upptäcka SARS-CoV-2 RNA i HAE-kulturer och Vero-celler. Tekniken omfattar följande steg: (1) fixering av celler med paraformaldehyd; 2. Permeabilisering med tvättmedel eller metanol (MeOH). (3) Rehydrering genom en graderad serie MeOH-lösningar (endast HAE-kulturer). 4. Detektion. (5) Förstärkning med HCR-teknik för att detektera SARS-CoV-2 RNA. 6. Immunostaining. och (7) avbildning under ett konfokalt mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH är en pålitlig metod för dubbelfärgning av RNA och cellulära proteiner. Här har ett modifierat immuno-RNA-FISH-protokoll beskrivits som möjliggör detektion av SARS-CoV-2 RNA och cellulära proteiner i cellinjer och HAE-kulturer. Detta protokoll kan anpassas för användning i olika cellmodeller inklusive cellmonalayers eller specifika vävnader. Metoden bygger på konceptet med en HCR som initieras av lämplig sondlokalisering. Därefter resulterar användningen av split-initiator sonder för att …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och högre utbildning för forskning om SARS-CoV-2, och av bidrag från National Science Center (beviljar UMO2017/27/B/NZ6/02488 till K.P. och UMO-2018/30/E/NZ1/00874 till A.K.-P.).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
Riferimenti
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
