Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi
Summary
Burada, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA’yı görselleştirmek için RNA floresan in situ hibridizasyonunu (RNA-FISH) immünofluoresans ile birleştiren basit bir yöntemi açıklıyoruz. Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA konakçı etkileşimlerinin moleküler özelliklerinin tek hücre düzeyinde anlaşılmasını artırabilir.
Abstract
Bu makale, hücre hattında şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA’sını ve insan hava yolu epitelinin üç boyutlu (3D) kültürlerini görselleştirmek için immünofluoresans ile birlikte in situ hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) için bir protokol sunmaktadır. Yöntem, prob lokalizasyonu tarafından başlatılan HCR’ye güvenerek viral RNA’nın son derece spesifik ve hassas görselleştirilmesine izin verir. Bölünmüş başlatıcı problar, floresan etiketli amplifikatörler tarafından sinyalin güçlendirilmiş hale gelir ve konfokal mikroskopide ihmal edilebilir arka plan floresan ile sonuçlanır. Amplifikatörlerin farklı floresan boyalarla etiketlenerek çeşitli hedeflerin aynı anda tanınmasını kolaylaştırır. Bu da, dokulardaki enfeksiyonun haritalandırılmasının viral patogenez ve replikasyonunu tek hücre düzeyinde daha iyi anlamasını sağlar. Bu yöntemin immünofluoresans ile birleşmesi, konak epigenomunun değişimi ve immün yanıt yolları da dahil olmak üzere konak-virüs etkileşimlerinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir. Hassas ve spesifik HCR teknolojisi sayesinde, bu protokol bir tanı aracı olarak da kullanılabilir. Tekniğin, gelecekte ortaya çıkabilecek kodlamayan RNA’lar ve RNA virüsleri de dahil olmak üzere herhangi bir RNA’nın algılanmasını sağlamak için kolayca değiştirilebileceğini hatırlamak da önemlidir.
Introduction
SARS-CoV-2, 2019’un sonunda ortaya çıkan ve birkaç ay sonra benzeri görülmemiş bir pandemiye neden olan yeni bir insan betakoronavirüsüdür. Virüs bilimde yeni olduğu için biyolojisinin çoğu ve konak hücreler üzerindeki etkisi bilinmemektedir. Bu nedenle, temel biyolojik özellikleri ve konak üzerindeki etkileri anlaşılacaksa, enfeksiyon sırasında virüs-hücre ve -doku tromizminin haritalandırılması önemlidir. Biyokimyasal, biyolojik ve fiziksel tahliller de dahil olmak üzere virüs konak etkileşimlerini incelemek için çeşitli teknikler kullanılır. In situ hibridizasyon, bir hücre veya dokudaki belirli DNA veya RNA dizilerine lokalize olan etiketli tamamlayıcı DNA, RNA veya değiştirilmiş nükleik asit probları kullanan yaygın bir yöntemdir.
Bir HCR1ile sinyal-gürültü oranını yükselterek hassasiyeti artırmak için değişiklikler içeren yeni bir RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) yöntemi geliştirilmiştir. HCR, RNA lokalizasyonunun tek hücre düzeyinde incelenmesine izin verir. Yüksek özgüllüğü, duyarlılığı ve çözünürlüğü nedeniyle, bu yöntem sadece temel bilim çalışmaları için değil, aynı zamanda uygulama projeleri için de yararlıdır, örneğin teşhis. Son zamanlarda, bu yöntemin fizibilitesi, tamamen farklılaştırılmış 3D insan hava yolu epitel (HAE) kültürleri içinde siliated hücrelere lokalize SARS-CoV-2 RNA’sını tespit etmek için gösterilmiştir2. HAE kültürleri, “doğal enfeksiyon” mikroçevrimiz3,4bağlamında viral enfeksiyonu incelemek için kullanılan en gelişmiş araçlardan birini oluşturur.
SARS-CoV-2 de dahil olmak üzere insan koronavirüsleri (HCoV) hakkında çeşitli raporlar, HCoV enfeksiyonu ve patofizyolojisi açısından epigenetik değişikliklerin önemini vurgulamaktadır [5’tegözden geçirilmiştir ], örneğin, anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE-2) reseptörü6,7’yikodlayan genin metilasyon deseni. İlginçtir ki, kütle spektrometrik taraması SARS-CoV-2 proteom8ile etkileşime giren birkaç epigenetik faktör tanımladı. Daha spesifik olarak, yapısal olmayan protein 5 (NSP5) epigenetik regülatöre bağlanır, histone deacetylaz 2 ve katalitik olarak inaktif NSP5 (C145A) tRNA metiltransfeaz 1 (24) ile etkileşime girer. Ek olarak, NSP16 metiltransferaz aktivitesi metiltransferaz inhibitörü, sinefungin9tarafından engellenir. Ancak bu epigenetik faktörlerin COVID-19’daki kesin rolü belirsizliğini korumaktadır. HCoV replikasyonu enfekte hücrenin sitoplazmında gerçekleşir ve epigenetik değişikliklerle düzenlenen enflamatuar yanıtları tetikler10.
Örneğin, HCoV-229E nükleer faktör-kappa B sinyalini ince ayarlar ve belirli bölgelerde H3K36 ve H4K5’in asetilasyonını artırarak konak hücresel kromatin manzarasını derinden yeniden programlar11. Orta Doğu solunum sendromuna bağlı koronavirüs enfeksiyonu H3K27me3 seviyelerini arttırır ve spesifik interferon duyarlı genlerin alt kümelerinin promotör bölgelerinde H3K4me3’ün tükenmesi12. Ek olarak, viral RNA, flavivirüsler13, retrovirüsler 14,15ve koronavirüsler16için gösterildiği gibi hücre immün yanıtlarını tetikler. Viral RNA’daki epigenetik belirteçler, insan immün yetmezlik virüsünün m7A metilasyonunda gösterildiği gibi hücresel sensörler tarafından tanınmada rol oynayabilir-1 RNA17. Bununla birlikte, sorular devam etmektedir: SARS-CoV-2 RNA’nın bağışıklık yanıtı üzerindeki etkisi nedir ve epigenetik izler söz konusu mudur?
Burada, hücre hatlarının ve 3D dokuların (tamamen farklılaştırılmış HAE) immünofluoresans analizi ile birlikte optimize edilmiş bir RNA-FISH yöntemi tanımlanmıştır. FISH ve immunofluorescence gibi sitolojik yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, HCR tabanlı bu yeni nesil in situ hibridizasyon yöntemi hiçbir zaman virüs tespiti için kullanılmamıştır (yeni bir yayın hariç)2. Genel olarak, immünostaining ve FISH aşağıdaki adımları gerektirir: probların veya antikorların penetrasyonunu sağlamak için permeabilizasyon; hücresel malzemenin sabit ve korunduğu sabitleme; antikorların veya nükleik asit problarının uygulandığı tespit; ve son olarak, görselleştirme için örneklerin montajı.
Mevcut protokoller bu genel özellikleri paylaşsa da, ilgili parametrelere göre belirgin bir şekilde değişir. Burada, HAE kültürlerinde ve Vero hücrelerinde SARS-CoV-2 RNA’sını tespit etmek için optimize edilmiş, basit, immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Teknik aşağıdaki adımları içerir: (1) paraformaldehitli hücrelerin sabitlenmesi; (2) deterjan veya metanol (MeOH) ile permeabilizasyon; (3) dereceli bir dizi MeOH çözümü ile rehidrasyon (yalnızca HAE kültürleri); (4) algılama; (5) SARS-CoV-2 RNA’yı tespit etmek için HCR teknolojisini kullanarak amplifikasyon; (6) immünostaining; ve (7) konfokal mikroskop altında görüntüleme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-RNA-FISH, RNA ve hücresel proteinlerin çift boyanma için güvenilir bir yöntemdir. Burada, hücre hatlarında ve HAE kültürlerinde SARS-CoV-2 RNA ve hücresel proteinlerin tespit edilmesine izin veren değiştirilmiş bir immün-RNA-FISH protokolü tanımlanmıştır. Bu protokol, hücre monolayerleri veya belirli dokular dahil olmak üzere farklı hücre modellerinde kullanılmak üzere uyarlanabilir. Yöntem, uygun prob yerelleştirmesi tarafından başlatılan bir HCR kavramına dayanır. Daha sonra, siny…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma SARS-CoV-2 ile ilgili araştırmalar için Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından ve Ulusal Bilim Merkezi’nden hibelerle desteklendi (UMO2017/27/B/NZ6/02488’i K.P.’ye ve UMO-2018/30/E/NZ1/00874’ü A.K.-P.’ye verir).
Materials
| Equipment | |||
| Confocal Microscope LSM 880 | ZEISS | ||
| Grant Bio, Mini Rocker- Shaker | Fisher Scientific | 12965501 | |
| Incubator Galaxy170R | New Brunswick | CO170R-230-1000 | |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 5355 000 011 | |
| Materials | |||
| 15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips | LabSolute | 7695022 | |
| 1.5 mL tubes | FL-MEDICAL | 5.350.023.053 | |
| 12-well plate | TTP | 92412 | |
| Conical centrifuge tube | Sarstedt | 5.332.547.254 | |
| parafilm | Sigma | P7793-1EA | |
| serological pipets | VWR Collection | 612-5523P, 612-5827P | |
| slide glass | PTH CHEMLAND | 04-296.202.03 | |
| Transwell ThinCerts | Grainer bio-one | 665641 | |
| Reagents | |||
| Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies | Invitrogen | ||
| β5-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | sc-134234 | |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | |
| Disodium phosphate | Sigma | S51136-500G | |
| EGTA | BioShop | EGT101.25 | |
| HCR Amplification Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BAM01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S013922 | |
| HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 | Molecular Instruments, Inc. | S012522 | |
| HCR Probe Hybridization Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPH03821 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid | Molecular Instruments, Inc. | PRE134 | |
| HCR Probe Wash Buffer | Molecular Instruments, Inc. | BPW01522 | Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information |
| HEPES | BioShop | HEP001.100 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methanol | Sigma | 32213-1L-M | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655-100G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | |
| PIPES | BioShop | PIP666.100 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P5405-250G | |
| Prolong Diamond Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36970 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.5 | |
| Trisodium Citrate 2-hydrate | POCH | 6132-04-3 | |
| Tween-20 | BioShop | TWN580.500 | |
| Software | |||
| Fluorescence Spectraviewer | Modeling spectral parameters | ||
| ImageJ Fiji | Acquiring and processing z-stack images |
Riferimenti
- Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
- Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
- Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
- Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
- El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
- Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
- Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
- Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
- Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
- Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
- Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
- Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
- Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
- Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
- Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
- Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
- Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).
