भ्रूण Microinjection और नॉकआउट उत्परिवर्ती CRISPR / Cas9 जीनोम-संपादित हेलिकोवेर्पा Armigera (Hübner) की पहचान
Summary
यहाँ प्रस्तुत हेलिकोवेर्पा armigera (Hübner) भ्रूण microinjection और नॉकआउट उत्परिवर्ती पहचान CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन द्वारा बनाई गई पहचान का एक प्रोटोकॉल है। उत्परिवर्ती कीड़े जीन समारोह और विवो में विभिन्न जीनों के बीच बातचीत के आगे के शोध को सक्षम करते हैं।
Abstract
कपास बॉलवर्म, हेलिकोवेर्पा आर्मिगेरा, दुनिया में सबसे विनाशकारी कीटों में से एक है। आणविक आनुवांशिकी, शरीर विज्ञान, कार्यात्मक जीनोमिक्स और व्यवहार अध्ययनों के संयोजन ने एच. आर्मिगेरा को लेपिडोप्टेरा नोक्टुइडी में एक मॉडल प्रजाति बना दिया है। विभिन्न जीनों के इन विवो कार्यों और उनके बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/ संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) जीनोम संपादन तकनीक कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक सुविधाजनक और प्रभावी विधि है। इस अध्ययन में, हम CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करके H. armigera में जीन नॉकआउट को पूरा करने के लिए एक चरण-दर-चरण व्यवस्थित विधि प्रदान करते हैं। गाइड आरएनए (जीआरएनए) के डिजाइन और संश्लेषण का विस्तार से वर्णन किया गया है। फिर, गाइड आरएनए (जीआरएनए) निर्माण, भ्रूण संग्रह, माइक्रोइंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमर डिजाइन से युक्त बाद के चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। अंत में, जीन संपादन की दक्षता में सुधार करने के लिए समस्या निवारण सलाह और नोट्स प्रदान किए जाते हैं। हमारी विधि CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के आवेदन के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगी एच armigera के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य Lepidopteran पतंगों में.
Introduction
जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग विभिन्न प्रजातियों में लक्ष्य-जीन उत्परिवर्ती प्राप्त करने के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है। Clustered नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)/ संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) प्रणाली का उद्भव जीनोम 1 में हेरफेर करने के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करता है। CRISPR /Cas9 प्रणाली में एक गाइड आरएनए (gRNA) और Cas9 endonuclease2,3 शामिल हैं, जबकि gRNA को आगे दो भागों में विभाजित किया जा सकता है, एक लक्ष्य पूरक CRISPR RNA (crRNA) और एक ट्रांस-एक्टिवेटिंग crRNA (tracrRNA)। GRNA Cas9 एंडोन्यूक्लिएज के साथ एकीकृत होता है और एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) बनाता है। GRNA के साथ, Cas9 एंडोन्यूक्लिएज को आधार पूरकता के माध्यम से जीनोम की एक विशिष्ट साइट पर निर्देशित किया जा सकता है। Cas9 के RuvC और HNH डोमेन प्रोटोस्पेसर-आसन्न आकृति (PAM) अनुक्रम से पहले जीनोम तीन आधारों के लक्ष्य स्थल को क्लीव करते हैं और एक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) बनाते हैं। डीएनए दरार को तब दो तंत्रों के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, गैर-होमोलोगस एंड जॉइनिंग (एनएचईजे) या होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) 4। डीएसबी की मरम्मत लक्षित जीन को निष्क्रिय करने के तरीके के रूप में सम्मिलन या विलोपन का परिचय देती है, संभावित रूप से जीन फ़ंक्शन का पूरा नुकसान पैदा करती है। इसलिए, CRISPR / Cas9 प्रणाली की तर्कसंगत और विशिष्टता इसे विवो में जीन कार्यों को चिह्नित करने और जीन इंटरैक्शन 5 का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत विधि बनाती है।
कई गुणों के साथ, CRISPR / Cas9 प्रणाली को बायोमेडिसिन 6,7, जीन थेरेपी 8,9, और कृषि 10,11,12 सहित विभिन्न क्षेत्रों में लागू किया गया है, और सूक्ष्मजीवों 13, पौधों 14,15, नेमाटोड 16 और स्तनधारियों सहित विभिन्न जैविक प्रणालियों के लिए उपयोग किया गया है। . अकशेरुकी में, कई कीट प्रजातियों को CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के अधीन किया गया है, जैसे कि फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर और 18,19,20,21,22 से परे।
हेलिकोर्पा आर्मिगेरा दुनिया भर में सबसे विनाशकारी कीटों में से एक है23, और कपास, सोयाबीन और ज्वार 24,25 सहित कई फसलों को नुकसान पहुंचाता है। अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, एच आर्मिगेरा के जीनोम, साथ ही साथ लेपिडोप्टेरा कीट प्रजातियों की एक श्रृंखला को पूरी तरह से अनुक्रमित किया गया है26,27,28,29। हाल के वर्षों में इन कीड़ों से बड़ी संख्या में प्रतिरोध और घ्राण रिसेप्टर जीन की पहचान की गई है और उनकी विशेषता है19,27,28,29। कुछ प्रतिरोध से संबंधित जीनों की पहचान एच आर्मिगेरा में की गई है, जैसे कि कैडरिन 30 के लिए एन्कोडिंग जीन, एक एटीपी-बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर 31,32, साथ ही साथ HaTSPAN133। CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके इन जीनों के नॉकआउट के परिणामस्वरूप अतिसंवेदनशील उपभेदों में बैसिलस थुरिंगेनेसिस (बीटी) विष के लिए प्रतिरोध का एक उच्च स्तर होता है। इसके अलावा, चांग एट अल (2017) ने एक फेरोमोन रिसेप्टर को खटखटाया, जिसने संभोग समय विनियमन 19 में अपने महत्वपूर्ण कार्य को मान्य किया। इन रिपोर्टों से पता चलता है कि CRISPR / Cas9 कीट प्रणालियों में विवो में जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में कार्य कर सकता है। हालांकि, कीट प्रणालियों में CRISPR / Cas9 संशोधन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया अधूरी बनी हुई है, जो कीट कार्यात्मक जीनोमिक्स में इसकी आवेदन सीमा को सीमित करती है।
यहां, हम CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करके H. armigera में एक कार्यात्मक जीन को खटखटाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जिसमें जीआरएनए उत्पादन, भ्रूण संग्रह, माइक्रोइंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती पहचान के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमरों के डिजाइन और तैयारी शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल एच. आर्मिगेरा में किसी भी कार्यात्मक जीन में हेरफेर करने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ के रूप में कार्य करता है और इसे अन्य लेपिडोप्टेरा प्रजातियों तक बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR /Cas9 प्रणाली के अनुप्रयोग ने विभिन्न जीनों के बीच जीन फ़ंक्शन और इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए शक्तिशाली तकनीकी सहायता प्रदान की है। विस्तृत प्रोटोकॉल जो हम यहां प्रस्तुत करते हैं, CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31725023, जीडब्ल्यू के 31861133019, और सीवाई के लिए 31171912) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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