Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Apresentado aqui está um protocolo de microinjeção de embrião Helicoverpa armigera (Hübner) e identificação mutante nocaute criada pela edição do genoma CRISPR/Cas9. Insetos mutantes permitem mais pesquisas sobre a função genética e a interação entre diferentes genes in vivo.
Abstract
O algodão bollworm, Helicoverpa armigera, é uma das pragas mais destrutivas do mundo. Uma combinação de genética molecular, fisiologia, genômica funcional e estudos comportamentais fez de H. armigera uma espécie modelo em Lepidoptera Noctuidae. Para estudar as funções in vivo e interações entre diferentes genes, agrupadas regularmente repetições palindômicas curtas interespaçadas (CRISPR)/ proteína associada 9 (Cas9) é um método conveniente e eficaz usado para a realização de estudos genômicos funcionais. Neste estudo, fornecemos um método sistemático passo a passo para completar o nocaute genético em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. O design e a síntese do guia RNA (gRNA) são descritos em detalhes. Em seguida, são resumidas as etapas subsequentes que consistem no projeto de primer específico de genes para criação de RNA guia (gRNA), coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e detecção de mutantes. Finalmente, conselhos e notas de solução de problemas são fornecidos para melhorar a eficiência da edição de genes. Nosso método servirá como referência para a aplicação da edição de genomas CRISPR/Cas9 em H. armigera , bem como outras mariposas lepidopteranas.
Introduction
A aplicação da tecnologia de edição de genomas fornece uma ferramenta eficiente para alcançar mutantes de genes-alvo em diversas espécies. O surgimento do sistema de repetições palindômicas curtas interespaçadas regularmente (CRISPR)/proteína associada 9 (Cas9) fornece um novo método para manipular genomas1. O sistema CRISPR/Cas9 consiste em um RNA guia (gRNA) e o endonuclease Cas92,3, enquanto o gRNA pode ser ainda dividido em duas partes, um RNA CRISPR complementar de destino (crRNA) e um crRNA trans-ativante (tracrRNA). O gRNA se integra com a endonuclease Cas9 e forma uma ribonucleoproteína (RNP). Com o gRNA, o cas9 endonuclease pode ser direcionado para um local específico do genoma via complementação base. Os domínios RuvC e HNH do Cas9 têm o local alvo do genoma três bases antes da sequência protoespacial adjacente (PAM) e criam uma quebra de dois fios (DSB). O decote de DNA pode então ser reparado através de dois mecanismos, a junção final não homólogo (NHEJ) ou o reparo direcionado à e homologia (HDR)4. O reparo do DSB introduz inserções ou exclusões como forma de inativar o gene alvo, causando potencialmente uma perda completa da função genética. Assim, o herediável e a especificidade do sistema CRISPR/Cas9 fazem dele um método robusto para caracterizar funções genéticas in vivo e analisar interações genéticas5.
Com inúmeros méritos, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido aplicado a diversos campos, incluindo biomedicina6,7, terapia genética8,9 e agricultura10,11,12, e tem sido utilizado para vários sistemas biológicos, incluindo microrganismos13, plantas14,15, nematodes16 e mamíferos17 . Nos invertebrados, muitas espécies de insetos foram submetidas à edição do genoma CRISPR/Cas9, como a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e além de 18,19,20,21,22.
A helicoverpa armigera é uma das pragas mais destrutivas do mundo23, e danifica inúmeras culturas, incluindo algodão, soja e sorgo24,25. Com o desenvolvimento da tecnologia de sequenciamento, o genoma de H. armigera, bem como o de uma gama de espécies de insetos Lepidoptera, foram sequenciados completamente26,27,28,29. Um grande número de genes de resistência e receptores olfativos foram identificados e caracterizados a partir desses insetos nos últimos anos19,27,28,29. Alguns genes relacionados à resistência foram identificados em H. armigera, como os genes codificados para cadherin30, um transporte de de ligação ATP31,32, bem como HaTSPAN133. O nocaute desses genes usando a tecnologia CRISPR/Cas9 resulta em um alto nível de resistência à toxina Bacillus thuringiensis (BT) em cepas suscetíveis. Além disso, Chang et al. (2017) derrubaram um receptor de feromônio, que validou sua função significativa na regulação do tempo de acasalamento19. Esses relatórios sugerem que o CRISPR/Cas9 pode atuar como uma ferramenta eficaz para estudar a função genética in vivo em sistemas de insetos. No entanto, um procedimento detalhado para a modificação crispr/cas9 em sistemas de insetos permanece incompleto, o que limita sua gama de aplicação em genômica funcional de insetos.
Aqui, apresentamos um protocolo para eliminar um gene funcional em H. armigera usando o sistema CRISPR/Cas9. Um protocolo passo-a-passo detalhado é fornecido, incluindo o projeto e a preparação de primers específicos de genes para produção de gRNA, coleta de embriões, microinjeção, criação de insetos e identificação de mutantes. Este protocolo serve como uma referência valiosa para manipular quaisquer genes funcionais em H. armigera e pode ser estendido a outras espécies de Lepidoptera.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aplicação do sistema CRISPR/Cas9 forneceu poderoso suporte técnico para a análise da função genética e interação entre vários genes. O protocolo detalhado que apresentamos aqui demonstra a geração de um mutante homozigoto em H. armigera via edição de genomas CRISPR/Cas9. Este procedimento confiável fornece uma maneira simples de mutagênese genética direcionada em H. armigera.
A escolha dos locais-alvo do CRISPR pode afetar a eficiência da <sup class="xref"…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 à GW, e 31171912 à CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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