Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.
Der Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera, ist einer der zerstörerischsten Schädlinge der Welt. Eine Kombination aus Molekulargenetik, Physiologie, funktioneller Genomik und Verhaltensstudien hat H. armigera zu einer Modellart in Lepidoptera Noctuidae gemacht. Um die In-vivo-Funktionen und Interaktionen zwischen verschiedenen Genen zu untersuchen, ist die Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Associated Protein 9 (Cas9) Genom-Editing-Technologie eine bequeme und effektive Methode zur Durchführung funktioneller genomischer Studien. In dieser Studie stellen wir eine schrittweise systematische Methode zur Verfügung, um den Gen-Knockout bei H. armigera mit dem CRISPR/Cas9-System abzuschließen. Das Design und die Synthese der Guide-RNA (gRNA) werden detailliert beschrieben. Anschließend werden die nachfolgenden Schritte, bestehend aus genspezifischem Primer-Design für die Erstellung von Guide-RNA (gRNA), Embryonenentnahme, Mikroinjektion, Insektenaufzucht und Mutantendetektion zusammengefasst. Schließlich werden Ratschläge und Hinweise zur Fehlerbehebung bereitgestellt, um die Effizienz der Genbearbeitung zu verbessern. Unsere Methode wird als Referenz für die Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung bei H. armigera sowie anderen Schmetterlingen dienen.
Die Anwendung der Genom-Editing-Technologie bietet ein effizientes Werkzeug, um Ziel-Gen-Mutanten in verschiedenen Arten zu erreichen. Die Entstehung des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Associated Protein 9 (Cas9)-Systems bietet eine neuartige Methode zur Manipulation von Genomen1. Das CRISPR/Cas9-System besteht aus einer Guide-RNA (gRNA) und der Cas9-Endonuklease2,3, während die gRNA weiter in zwei Teile unterteilt werden kann, eine zielkomplementäre CRISPR-RNA (crRNA) und eine transaktivierende crRNA (tracrRNA). Die gRNA integriert sich in die Cas9-Endonuklease und bildet ein Ribonukleoprotein (RNP). Mit der gRNA kann die Cas9-Endonuklease über Basenkomplementation auf eine bestimmte Stelle des Genoms gerichtet werden. Die RuvC- und HNH-Domänen des Cas9 spalten die Zielstelle des Genoms drei Basen vor der Pam-Sequenz (Protospacer-Adjacent Motif) und erzeugen einen Doppelstrangbruch (DSB). Die DNA-Spaltung kann dann durch zwei Mechanismen repariert werden, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)4. Die Reparatur des DSB führt Insertionen oder Deletionen ein, um das Zielgen zu inaktivieren, was möglicherweise zu einem vollständigen Verlust der Genfunktion führt. Daher machen die Hierisierbarkeit und Spezifität des CRISPR/Cas9-Systems es zu einer robusten Methode, um Genfunktionen in vivo zu charakterisieren und Geninteraktionen zu analysieren5.
Mit zahlreichen Vorzügen wurde das CRISPR/Cas9-System auf verschiedene Bereiche angewendet, darunter Biomedizin6,7, Gentherapie8,9 und Landwirtschaft10,11,12, und wurde für verschiedene biologische Systeme verwendet, darunter Mikroorganismen13, Pflanzen14,15, Nematoden16 und Säugetiere17 . Bei Wirbellosen wurden viele Insektenarten der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung unterzogen, wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster und darüber hinaus18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera ist einer der zerstörerischsten Schädlinge weltweit23 und schädigt zahlreiche Nutzpflanzen, darunter Baumwolle, Sojabohnen und Sorghum24,25. Mit der Entwicklung der Sequenzierungstechnologie wurden das Genom von H. armigera sowie das einer Reihe von Lepidoptera-Insektenarten vollständig sequenziert26,27,28,29. Aus diesen Insekten wurde in den letzten Jahren eine große Anzahl von Resistenz- und Geruchsrezeptorgenen identifiziert und charakterisiert19,27,28,29. Einige resistenzbezogene Gene wurden in H. armigera identifiziert, wie die Gene, die für Cadherin30, einen ATP-bindenden Kassettentransporter31,32, sowie HaTSPAN133 kodieren. Das Ausschalten dieser Gene mittels CRISPR/Cas9-Technologie führt zu einer hohen Resistenz gegen Bacillus thuringiensis (BT)-Toxin in anfälligen Stämmen. Außerdem schalteten Chang et al. (2017) einen Pheromonrezeptor aus, der seine signifikante Funktion bei der Paarungszeitregulation bestätigte19. Diese Berichte deuten darauf hin, dass CRISPR/Cas9 als wirksames Instrument zur Untersuchung der Genfunktion in vivo in Insektensystemen dienen kann. Ein detailliertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Modifikation in Insektensystemen ist jedoch noch unvollständig, was sein Anwendungsspektrum in der funktionellen Genomik von Insekten einschränkt.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein funktionelles Gen in H. armigera mit dem CRISPR/Cas9-System auszuschalten. Ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll wird bereitgestellt, einschließlich des Designs und der Vorbereitung von genspezifischen Primern für die gRNA-Produktion, Embryonenentnahme, Mikroinjektion, Insektenaufzucht und Mutantenidentifizierung. Dieses Protokoll dient als wertvolle Referenz zur Manipulation beliebiger funktioneller Gene in H. armigera und kann auf andere Lepidoptera-Arten ausgedehnt werden.
Die Anwendung des CRISPR/Cas9-Systems hat eine leistungsstarke technische Unterstützung für die Analyse der Genfunktion und -interaktion zwischen verschiedenen Genen bereitgestellt. Das detaillierte Protokoll, das wir hier vorstellen, zeigt die Erzeugung einer homozygoten Mutante in H. armigera mittels CRISPR/Cas9 Genome Editing. Dieses zuverlässige Verfahren bietet einen einfachen Weg für die gerichtete Genmutagenese bei H. armigera.
Die Wahl der CRISPR-Zielorte könnte …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 gw und 31171912 cy) unterstützt.
2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |