اكتشاف المنظمين النقيلي باستخدام نموذج الغشاء السريع والكمي داخل الفرخ Chorioallantoic
Summary
هذه طريقة فعالة لفحص المكثفات أو محركات الانبثاث السرطاني. يتم حقن الخلايا ، التي يتم تحويلها باستخدام مكتبة التعبير ، في الأوعية الدموية للغشاء المشيمي للدجاج لتشكيل مستعمرات منتشرة. يتم استئصال المستعمرات التي انخفضت أو زادت من الغازية ، وتوسيعها ، وإعادة حقنها لتأكيد النمط الظاهري ، وأخيرا ، تحليلها باستخدام تسلسل الإنتاجية العالية.
Abstract
وقد أظهرت التطورات الأخيرة في أبحاث السرطان الطبيعة المعقدة للغاية لنبث السرطان. تم العثور على جينات أو شبكات جينات متعددة تشارك في التنظيم التفاضلي لجينات التعاقب النقيلي للسرطان والمنتجات الجينية التي تعتمد على نوع السرطان والأنسجة وخصائص المريض الفردية. وتمثل هذه الأهداف أهدافا هامة محتملة للعلاجات الوراثية ونهج الطب الشخصي. وتطوير منصات الفحص السريع أمر أساسي لتحديد هذه الأهداف الجينية.
الغشاء الفرخ chorioallantoic (CAM) هو غشاء غني بالكولاجين عالي الأوعية الدموية يقع تحت قشر البيض الذي يسمح بتبادل الغاز في الجنين النامي. نظرا لموقع وتدوير الأوعية الدموية للكام، قمنا بتطويره كنموذج الانبثاث السرطاني داخل الجسم البشري الذي يسمح لخلايا سرطان الإنسان القوية xenografting والتصوير في الوقت الحقيقي من التفاعلات الخلية السرطانية مع مصفوفة الكولاجين الغنية وvasculature.
وباستخدام هذا النموذج، تم تصميم منصة فحص كمي لتحديد الدوافع الجديدة أو القامعين لنبث السرطان. قمنا بنقل مجموعة من الخلايا السرطانية HEp3 الرأس والرقبة مع مكتبة الجينات shRNA الجينوم البشري الكامل، ثم حقن الخلايا، في كثافة منخفضة، في الأوعية الدموية CAM. انتشرت الخلايا وشكلت مستعمرات الخلايا أحادية الورم. كانت المستعمرات الفردية التي لم تتمكن من غزو أنسجة CAM مرئية كنموذج فينوتيبي مستعمرة مدمجة وتم استئصالها لتحديد الحمض النووي الريبي المنقول الموجود في الخلايا. تم تقييم صور المستعمرات الفردية لتوغلها. تم إجراء جولات متعددة من التحديدات لتقليل معدل الإيجابيات الزائفة. وقد خضعت استنساخات الخلايا السرطانية الفردية والمعزولة أو المستنسخات المهندسة حديثا التي تعبر عن الجينات ذات الاهتمام إلى فحص تكوين الورم الأولي أو تحليل الخيار المشترك للخلايا السرطانية. باختصار نقدم منصة فحص سريعة تسمح بتحديد الأهداف المضادة للمنبث والتحليل داخل الجسم لسلسلة ديناميكية ومعقدة من الأحداث.
Introduction
الانبثاث هو السبب الرئيسي لوفاة مريض السرطان1،2،3. تستخدم الخلايا السرطانية النقيلية مسارات إشارات متميزة ، تعتمد على نوع السرطان ، طوال الخطوات الخمس من السلسلة النقيلية: الغزو المحلي ، والغزو الداخلي ، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية ، والبذخ ، وتوسع المستعمرة في المواقع النقيلية البعيدة. الفهم الحالي لهذه العملية النقيلية يشير إلى أن هناك خطوتين عنق الزجاجة، واحدة هي الغزو الاتجاهي للخلية السرطانية من الورم الأساسي، والثاني هو إنشاء آفة النقيلي موقع بعيد4،5،6. تتطلب كلتا الخطوتين تفاعل الخلايا السرطانية بنشاط مع الكولاجين والشرايين في مواقع الغزو الأولي أو تكوين الآفة النقيلية البعيدة. لذلك، يجب أن تكون الخلايا السرطانية النقيلي قادرة على إرفاق الخلايا، وإعادة تشكيلها ألياف الكولاجين، وغزو اتجاهي على طول جدران الأوعيةالدموية 7. نماذج الفحص التي يمكن أن تحدد بسرعة الأهداف العلاجية في وقت الذروة لمنع الخلايا السرطانية من إكمال هذه الخطوات هي ذات أهمية قصوى. نماذج الفحص المختبري الموجودة لا تحاكي تماما بيئة الأنسجة الحية المعقدة. نماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. لذلك، هناك حاجة ملحة لمنصات الفحص داخل الجسم التي توفر بيئات الأنسجة الحية المعقدة والتحديد السريع للأهداف.
خلال العقد الماضي، تم تأسيس جنين الدجاج كنموذج قوي وفعال من حيث التكلفة من الانبثاث سرطان الإنسان8،9،10،11،12. الغشاء الفرخ chorioallantoic (CAM) الأنسجة رقيقة وشفافة مما يجعلها مثالية للتصوير المجهري داخل الجسم من سلوكيات الخلية والمستعمرة في الورم الأساسي و / أو المواقع النقيلي12. يمكن البدء في نمو الورم الأولي من عدة خطوط خلايا سرطان الإنسان ونقائل في غضون عدة أيام فقط بعد microinjection في أنسجة CAM. يمكن إعطاء الخلايا السرطانية في أنسجة CAM بعدة طرق ، بما في ذلك عن طريق الوريد أو داخل CAM أو كنباتات الكولاجين ، تسمح هذه المرونة للباحث بالتركيز على مراحل محددة من تطور السرطان ، على سبيل المثال ، تكوين الآفة النقيلية ، أو غزو الورم الأساسي أو تولد الأوعية.
هنا نصف منصة الفحص الكمي التي يمكن استخدامها لقياس قدرة الخلايا السرطانية على إنشاء الآفات النقيلية الغازية. يتم حقن الخلايا السرطانية التي تم نقلها مع مكتبة التعبير عن طريق الوريد في الأوعية الدموية CAM في كثافة منخفضة. تتشكل المستعمرات النقيلية لمدة 4-5 أيام ، ثم يتم تقييم قدرة الغزو والتفاعل الوعائي للمستعمرات الناتجة. يتم استئصال المستعمرات الفردية التي تفشل في الغزو ونشرها وتأكيد النمط الظاهري لها في CAM عن طريق إعادة الدمج والتحديد الكمي لإحكام المستعمرة واتصالات الخلايا الدموية السرطانية. يتم تحديد مكتبة التعبير يبني المسؤولة عن النمط الظاهري مستعمرة واحدة النقيلي متحولة من الحمض النووي الجينوم مستعمرة معزولة عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية. ويمكن استخدام المنصة نفسها كذلك للتحقق من صحة العلاقة السببية بين الجين والنمط الظاهري الملاحظ أو لإجراء دراسات ميكانيكية متعمقة على النمط الظاهري الملاحظ.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن نصف المجهر الفلوري السريع القائم على بروتوكول الفحص داخل الحتمية التي يمكن استخدامها لتطبيقات هامة مثل الشاشات الوراثية أو المخدرات المرشحة. يمكن فحص الخلايا السرطانية التي تم تحويلها مع مكتبة وراثية ذات أهمية أو متحولة مع بنيات التعبير الفردية بسرعة وقياسها كميا فيما يتعلق بال?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل معهد أبحاث جمعية السرطان الكندية منحة #702849 إلى JDL وKS. الدكتور لويس يحمل كرسي فرانك وكارلا سوجونكي في أبحاث سرطان البروستاتا بدعم من مؤسسة ألبرتا للسرطان.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van’t Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D., Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. . The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. , 27-37 (2016).
