גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי
Summary
זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בחקר הסרטן המחישה את האופי המורכב ביותר של גרורות סרטן. גנים או רשתות גנים רבים נמצאו מעורבים בוויסות דיפרנציאלי של גנים מפלים גרורתיים וסרטן ומוצרי גנים התלויים בסוג הסרטן, ברקמה ובמאפייני המטופלים הבודדים. אלה מייצגים יעדים פוטנציאליים חשובים לטיפולים גנטיים וגישות לרפואה מותאמת אישית. פיתוח פלטפורמות סינון מהירות חיוני לזיהוי מטרות גנטיות אלה.
קרום chorioallantoic אפרוח (CAM) הוא קרום עשיר מאוד וסקולני, קולגן הממוקם מתחת קליפת הביצה המאפשר חילופי גז בעובר המתפתח. בשל המיקום וכלי הדם של CAM, פיתחנו אותו כמודל גרורות סרטן אנושי תוך-וינטלי המאפשר קסנוגרפטציה של תאים סרטניים אנושיים חזקים והדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאים סרטניים עם מטריצה עשירה בקולגן vasculature.
באמצעות מודל זה, פלטפורמת הקרנה כמותית תוכננה לזיהוי של נהגים חדשים או מדכאים של גרורות סרטן. העברנו מאגר של תאי סרטן HEp3 ראש וצוואר עם ספריית גנים שלמה של גנום אנושי shRNA, ואז הזרקנו את התאים, בצפיפות נמוכה, לתוך vasculature CAM. התאים התרבו ויצרו מושבות תאים חד-גידוליים. מושבות בודדות שלא הצליחו לפלוש לרקמת CAM נראו כפנוטיפ מושבה קומפקטי ונקראו לזיהוי של shRNA transduced הנוכחי בתאים. תמונות של מושבות בודדות הוערכו על ה פולשניות שלהן. סבבים מרובים של בחירות בוצעו כדי להקטין את שיעור החיוביות השגויות. שיבוטים בודדים, מבודדים של תאים סרטניים או שיבוטים מהונדסים חדשים המבטאים גנים מעניינים היו נתונים לבדיקת היווצרות גידול ראשונית או ניתוח אופציות משותפות של כלי התא הסרטני. לסיכום אנו מציגים פלטפורמת סינון מהירה המאפשרת זיהוי יעד אנטי גרורתי וניתוח תוך-וינטלי של מפל אירועים דינמי ומורכב.
Introduction
גרורות הוא הגורם העיקרי למוות של חולה סרטן1,2,3. תאים סרטניים גרורתיים משתמשים במסלולי איתות ברורים, התלויים בסוג הסרטן, לאורך חמשת השלבים של המפל גרורתי: פלישה מקומית, תוך-פולשניות, הישרדות במחזור הדם, הפזרנות והרחבת המושבה באתרים גרורתיים מרוחקים. ההבנה הנוכחית של תהליך גרורתי זה מצביעה על כך שיש שני שלבים צוואר בקבוק, אחד הוא פלישה כיוונית של התא הסרטני מן הגידול העיקרי, והשני הוא הקמת הנגע גרורתי האתר הרחוק4,5,6. שני השלבים דורשים תאים סרטניים לקיים אינטראקציה פעילה עם קולגן vasculature באתרים של פלישה ראשונית או היווצרות נגע גרורתי רחוק. לכן, תאים סרטניים גרורתיים חייבים להיות מסוגלים להתחבר לתאים, לשפץ סיבי קולגן, בכיוון לפלוש לאורך קירות כלי הדם7. מודלים הקרנה שיכולים לזהות במהירות מטרות טיפוליות antimetastatic לחסום תאים סרטניים מלהשלים שלבים אלה הוא בעל חשיבות עליונה. מודלים קיימים של הקרנת במבחנה אינם מחקים באופן מלא את סביבת הרקמה החיה המורכבת. דגמי עכבר יקרים וגוזלים זמן רב. לכן, יש צורך דחוף בפלטפורמות סינון תוך-וינטליות המספקות סביבות רקמות חיות מורכבות וזיהוי מהיר של מטרות.
בעשור האחרון, עובר העוף הוקם כמודל חזק וחסכוני של גרורות סרטןאנושיות 8,9,10,11,12. רקמת הממברנה הכוריואלנטואית (CAM) של אפרוח היא דקה ושקופה מה שהופך אותה לאידיאלית להדמיה מיקרוסקופית תוך-וינטלית של התנהגויות תאים ומושבות באתרי גידול ו/או גרורתיים12. גידול ראשוני מקווי תאים סרטניים אנושיים מרובים ניתן ליזום גרורות בתוך טווח של מספר ימים בלבד לאחר microinjection לתוך רקמת CAM. תאים סרטניים יכולים להינתן לתוך רקמת CAM במספר דרכים, כולל תוך ורידי, תוך-CAM או כמו קולגן onplants, גמישות זו מאפשרת לחוקר להתמקד בשלבים ספציפיים של התקדמות הסרטן, למשל, היווצרות נגע גרורתי, פלישה מתוך הגידול העיקרי או אנגיוגנזה.
כאן אנו מתארים פלטפורמת סינון כמותית שניתן להשתמש בה כדי למדוד את היכולת של תאים סרטניים ליצור נגעים גרורתיים פולשניים. תאים סרטניים שהועברו עם ספריית ביטוי מוזרקים תוך ורידי לתוך vasculature CAM בצפיפות נמוכה. מושבות גרורתיות נוצרות במשך 4-5 ימים, ואז מעריכים את יכולת הפלישה ואת האינטראקציה של המושבות המתקבלות. מושבות בודדות שאינן פולשות מובאות, מופצים והפנוטיפ שלהן מאושר ב- CAM על ידי נסיגה וכימות של קומפקטיות המושבה ומגעים בין כלי דם לתאים סרטניים. ספריית הביטויים בונה אחראי על פנוטיפ מוטציה המושבה גרורתי יחיד מזוהים מדנ”א גנומי מושבה מבודד באמצעות רצף תפוקה גבוהה. אותה פלטפורמה עשויה לשמש עוד יותר כדי לאמת את הקשר הסיבתי בין גן פנוטיפ נצפה או לבצע מחקרים מכניים מעמיקים על פנוטיפ שנצפו.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מהירה המבוססת על פרוטוקול סינון תוך-וינטלי שניתן להשתמש בו עבור יישומים חשובים כגון מסכים גנטיים או מועמדים לתרופה. תאים סרטניים שהועברו עם ספרייה גנטית של עניין או שהודבקו עם מבני ביטוי בודדים ניתן לסנן במהירות ולכומת כמו פנוטיפ של עניין באמצעות …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר הקנדי למלחמה בסרטן גרנט #702849 ל- JDL ו- KS. ד”ר לואיס מחזיקה בכיסא פרנק וקרלה סוגיוני בחקר סרטן הערמונית בתמיכת הקרן לסרטן אלברטה.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van’t Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D., Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. . The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. , 27-37 (2016).
