Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo
Summary
Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.
Abstract
I recenti progressi nella ricerca sul cancro hanno illustrato la natura altamente complessa delle metastasi del cancro. È stato scoperto che più geni o reti di geni sono coinvolti nella regolazione differenziale dei geni a cascata metastatica del cancro e dei prodotti genici dipendenti dal tipo di cancro, dal tessuto e dalle caratteristiche individuali del paziente. Questi rappresentano obiettivi potenzialmente importanti per le terapie genetiche e gli approcci di medicina personalizzata. Lo sviluppo di piattaforme di screening rapido è essenziale per l’identificazione di questi bersagli genetici.
La membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è una membrana altamente vascolarizzata e ricca di collagene situata sotto il guscio d’uovo che consente lo scambio di gas nell’embrione in via di sviluppo. A causa della posizione e della vascolarizzazione del CAM, lo abbiamo sviluppato come modello di metastasi del cancro umano intravitale che consente un robusto xenotrapianto delle cellule tumorali umane e l’imaging in tempo reale delle interazioni delle cellule tumorali con la matrice e la vascolarizzazione ricche di collagene.
Utilizzando questo modello, è stata progettata una piattaforma di screening quantitativo per l’identificazione di nuovi driver o soppressori delle metastasi del cancro. Abbiamo trasdotto un pool di cellule tumorali HEp3 della testa e del collo con una libreria completa di geni shRNA del genoma umano, quindi iniettato le cellule, a bassa densità, nella vascolarizzazione CAM. Le cellule proliferarono e formarono colonie di cellule tumorali singole. Le singole colonie che non erano in grado di invadere il tessuto CAM erano visibili come fenotipo di colonia compatta e asportate per l’identificazione dello shRNA trasdotto presente nelle cellule. Le immagini delle singole colonie sono state valutate per la loro invasività. Sono stati eseguiti più cicli di selezioni per ridurre il tasso di falsi positivi. Cloni di cellule tumorali individuali e isolati o cloni di nuova progettazione che esprimono geni di interesse sono stati sottoposti a test di formazione tumorale primaria o analisi di cooptazione vascolare delle cellule tumorali. In sintesi presentiamo una piattaforma di screening rapido che consente l’identificazione del bersaglio anti-metastatico e l’analisi intravitale di una cascata dinamica e complessa di eventi.
Introduction
Le metastasi sono la principale causa di morte del pazienteoncologico1,2,3. Le cellule tumorali metastatiche utilizzano percorsi di segnalazione distinti, a seconda del tipo di cancro, attraverso le cinque fasi della cascata metastatica: invasione locale, intravaso, sopravvivenza nella circolazione, stravaso ed espansione della colonia in siti metastatici distanti. L’attuale comprensione di questo processo metastatico suggerisce che ci sono due fasi di collo di bottiglia, una è l’invasione direzionale della cellula tumorale dal tumore primario, e la seconda è la creazione della lesione metastatica del sito distante4,5,6. Entrambi i passaggi richiedono alle cellule tumorali di interagire attivamente con il collagene e la vascolarizzazione nei siti di invasione iniziale o formazione di lesioni metastatiche a distanza. Pertanto, le cellule tumorali metastatiche devono essere in grado di attaccarsi alle cellule, rimodellare le fibre di collagene e invadere direzionalmente lungo le paretivascolari 7. I modelli di screening in grado di identificare rapidamente bersagli terapeutici antimetastatici per impedire alle cellule tumorali di completare questi passaggi sono della massima importanza. I modelli di screening in vitro esistenti non imitano completamente il complesso ambiente dei tessuti vivi. I modelli murini sono costosi e richiedono molto tempo. Pertanto, vi è un urgente bisogno di piattaforme di screening intravitale che forniscano ambienti di tessuti vivi complessi e una rapida identificazione dei bersagli.
Nell’ultimo decennio, l’embrione di pollo è stato stabilito come un modello robusto ed economico di metastasi del cancro umano8,9,10,11,12. Il tessuto della membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è sottile e traslucido, il che lo rende ideale per l’imaging microscopico intravitale dei comportamenti cellulari e delle colonie nei siti tumorali primari e / o metastatici12. La crescita del tumore primario da più linee cellulari tumorali umane può essere avviata e metastatizzata in un arco di soli diversi giorni dopo la microiniezione nel tessuto CAM. Le cellule tumorali possono essere somministrate nel tessuto CAM in diversi modi, tra cui per via endovenosa, intra-CAM o come collagene onplants, questa flessibilità consente al ricercatore di concentrarsi su fasi specifiche della progressione del cancro, ad esempio la formazione di lesioni metastatiche, l’invasione dal tumore primario o l’angiogenesi.
Qui descriviamo una piattaforma di screening quantitativo che può essere utilizzata per misurare la capacità delle cellule tumorali di stabilire lesioni metastatiche invasive. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria di espressioni vengono iniettate per via endovenosa nella vascolarizzazione CAM a bassa densità. Le colonie metastatiche si formano per 4-5 giorni, quindi viene valutata la capacità di invasione e l’interazione vascolare delle colonie risultanti. Le singole colonie che non riescono a invadere vengono asportate, propagate e il loro fenotipo viene confermato nella CAM mediante reiniezione e quantificazione della compattezza delle colonie e dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno. I costrutti della libreria di espressioni responsabili del fenotipo mutante della singola colonia metastatica sono identificati dal DNA genomico della colonia isolata tramite sequenziamento ad alto rendimento. La stessa piattaforma può essere ulteriormente utilizzata per convalidare il nesso causale tra un gene e il fenotipo osservato o per eseguire studi meccanicistici approfonditi sul fenotipo osservato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un protocollo di screening intravitale basato sulla microscopia a fluorescenza rapida che può essere utilizzato per applicazioni importanti come gli screening genetici o dei farmaci candidati. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria genetica di interesse o trasfettate con costrutti di espressione individuale possono essere rapidamente vasate e quantificate in base al fenotipo di interesse utilizzando questo modello CAM di pulcino. Poiché i protocolli di trasduzione o trasfezione va…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del Canadian Cancer Society Research Institute #702849 a JDL e KS. Il Dr. Lewis detiene la cattedra Frank e Carla Sojonky nella ricerca sul cancro alla prostata supportata dalla Alberta Cancer Foundation.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
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