신속하고 정량적인 병아리 Chorioallantoic 멤브레인 모델을 사용하여 전이성 레귤레이터의 발견
Summary
이것은 암 전이의 억제제 또는 드라이버를 위해 검열하는 효과적인 방법입니다. 발현 라이브러리로 변환된 세포는 전이성 콜로니를 형성하기 위해 닭 초리오알란토아막 혈관에 주입됩니다. 감소 또는 증가 된 침략을 갖는 식민지는 절제, 확장, 자신의 표현형을 확인하기 위해 재주입, 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분석.
Abstract
암 연구에 있는 최근 어드밴스는 암 전이의 매우 복잡한 본질을 보여주었습니다. 다중 유전자 또는 유전자 네트워크는 암 유형, 조직 및 개별 환자 특성에 의존하는 암 전이성 캐스케이드 유전자 및 유전자 제품을 분화 조절하는 데 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 유전 치료 및 개인화된 약 접근을 위한 잠재적으로 중요한 표적을 나타냅니다. 급속한 검열 플랫폼의 발달은 이 유전 표적의 확인을 위해 필수적입니다.
병아리 chorioallantoic 막 (CAM)은 발달 배아에서 가스 교환을 허용하는 계란 껍질 아래에 위치한 고도로 혈관, 콜라겐이 풍부한 막입니다. CAM의 위치와 혈관화로 인해, 우리는 콜라겐이 풍부한 매트릭스 및 혈관과 암 세포 상호 작용의 견고한 인간 암 세포 xenografting 및 실시간 이미징을 허용하는 중요한 인간 암 전이 모델로 개발했습니다.
이 모델을 사용하여, 정량적 선별 플랫폼은 새로운 드라이버 또는 암 전이의 억제제의 식별을 위해 설계되었습니다. 우리는 완전한 인간 게놈 shRNA 유전자 라이브러리를 가진 머리와 목 HEp3 암세포의 풀을 변환하고, 그 후, 저밀도에서, CAM 혈관화로 세포를 주입했습니다. 세포는 증식하고 단하나 종양 세포 식민지를 형성했습니다. CAM 조직으로 침입할 수 없었던 개별 식민지는 소형 식민지 표현형으로 보였으며 세포에 존재하는 트랜스포이드 된 shRNA의 식별을 위해 절제되었다. 개별 식민지의 이미지는 그들의 침략에 대 한 평가 되었다. 거짓 긍정의 비율을 줄이기 위해 여러 번의 선택이 수행되었습니다. 관심 있는 유전자를 발현하는 개별, 고립된 암세포 클론 또는 새로 설계된 클론은 1차 종양 형성 분석 또는 암 세포 혈관 학 공동 선택 분석을 받게 되었다. 요약하면 우리는 전이성 방지 대상 식별 및 이벤트의 동적 및 복잡한 계단식 에 대한 인트라비티 분석을 허용하는 신속한 선별 플랫폼을 제시합니다.
Introduction
전이는 암 환자사망1,2,3의주요 원인입니다. 전이성 암세포는 전이성 캐스케이드의 다섯 단계에 걸쳐 암의 유형에 따라 뚜렷한 신호 경로를 활용합니다: 지역 침략, 인트라바션, 순환의 생존, 사치, 먼 전이성 부위의 식민지 확장. 이러한 전이성 과정의 현재 이해는 2개의 병목 현상 단계가 있다는 것을 건의하고, 하나는 1차 종양으로부터 암세포의 방향 침입이며, 두 번째는 먼 부위 전이성 병변4,5,6의확립이다. 두 단계 모두 암세포가 초기 침입 또는 먼 전이성 병변 형성 부위에서 콜라겐 및 혈관과 적극적으로 상호 작용하도록 요구합니다. 따라서 전이성 암세포는 세포에 부착하고, 콜라겐 섬유를 리모델링하고, 혈관 벽을 따라 방향적으로 침입할 수 있어야 한다7. 암세포가 이러한 단계를 완료하지 못하도록 차단하기 위해 항전정 치료 표적을 신속하게 식별할 수 있는 선별 모델은 가장 중요합니다. 기존 시험관 내 선별 모델은 복잡한 라이브 조직 환경을 완전히 모방하지 않습니다. 마우스 모델은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 따라서 복잡한 라이브 조직 환경과 표적의 신속한 식별을 제공하는 인트라베이트 스크리닝 플랫폼에 대한 긴급한 필요성이 있습니다.
지난 10년 이내에 닭배아는 인간암전이8,9,10,11,12의견고하고 비용 효율적인 모델로 확립되었다. 병아리 chorioallantoic 막 (CAM) 조직은 1 차종양 및 / 또는 전이성 부위에서 세포 및 식민지 행동의 중요한 현미경 이미징에 이상적이게 얇고 반투명이다12. 다중 인간 암 세포주로부터의 1 차적인 종양 성장은 CAM 조직으로 마이크로 주입 후에 불과 며칠의 범위 내에서 개시되고 전이될 수 있습니다. 암세포는 여러 가지 방법으로 CAM 조직으로 투여 될 수있다, 정맥을 포함, 내 -CAM 또는 콜라겐 종양으로, 이러한 유연성은 연구원이 암 진행의 특정 단계에 초점을 맞출 수 있습니다, 예를 들어, 전이성 병변 형성, 1 차 종양 또는 혈관 신생에서 침입.
여기서 우리는 침략적인 전이성 병변을 설치하는 암세포의 능력을 측정하는 데 사용될 수 있는 정량적 선별 플랫폼을 기술합니다. 발현 라이브러리로 유도된 암세포는 저밀도에서 CAM 혈관에 정맥내 주입된다. 전이성 식민지는 4-5일 동안 형성되며, 그 후 생성된 식민지의 침략 능력과 혈관 상호작용이 평가된다. 침입에 실패하는 개별 식민지는 절제되고, 전파되고 그들의 표현형은 식민지 소형및 암 세포 혈관 접촉의 재주입 및 정량화에 의해 CAM에서 확인됩니다. 단일 전이성 식민지 돌연변이 표현형을 담당하는 발현 라이브러리 구조는 높은 처리량 시퀀싱을 통해 격리된 식민지 게놈 DNA로부터 식별된다. 동일한 플랫폼은 유전자와 관찰된 표현형 사이의 인과 관계를 검증하거나 관찰된 표현형에 대한 심층적인 기계론적 연구를 수행하기 위해 더 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 유전 또는 약물 후보 스크린과 같은 중요한 응용프로그램에 이용될 수 있는 급속한 형광 현미경 검사법을 기반으로 한 인내 검열 프로토콜을 기술합니다. 관심있는 유전 라이브러리로 변환되거나 개별 발현 구조와 연관된 암세포는 이 병아리 CAM 모델을 사용하여 관심 표현형에 대해 빠르게 선별및 정량화될 수 있다. 변환 또는 트랜스페션 프로토콜은 라이브러리 유형에 따라 크게 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 암 학회 연구소 그랜트 #702849 JDL및 KS에 의해 지원되었다. 루이스 박사는 알버타 암 재단이 지원하는 전립선암 연구에서 프랭크와 칼라 소존키 의자를 보유하고 있습니다.
Materials
| 1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
| 2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
| 4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
| Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
| Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
| cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
| Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
| fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
| Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
| Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
| MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | many sources are available | ||
| Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
| small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
| Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
| Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
| U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
| Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van’t Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), 1742-1757 (2007).
- Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
- Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
- Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815 (2011).
- Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343 (2018).
- Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
- Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D., Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. . The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. , 27-37 (2016).
