Dette er en effektiv metode til at screene for undertrykkere eller førere af kræft metastaser. Celler, transduceret med et udtryk bibliotek, injiceres i kylling chorioallantoic membran vaskulatur til at danne metastatiske kolonier. Kolonier, der har nedsat eller øget invasivitet, fjernes, udvides, injiceres igen for at bekræfte deres fænotype og analyseres til sidst ved hjælp af høj gennemløbssekvensering.
De seneste fremskridt inden for kræftforskning har illustreret den meget komplekse karakter af kræftmetastase. Flere gener eller gener netværk har vist sig at være involveret i differentialligt regulere kræft metastatiske kaskade gener og genprodukter afhængige af kræft type, væv, og individuelle patientegenskaber. Disse repræsenterer potentielt vigtige mål for genetisk behandling og personlig medicin tilgange. Udviklingen af hurtige screeningsplatforme er afgørende for at identificere disse genetiske mål.
Kyllingen chorioallantoic membran (CAM) er en meget vaskulær, kollagen rig membran placeret under æggeskallen, der giver mulighed for gasudveksling i det udviklende embryo. På grund af placeringen og vaskularisering af CAM, udviklede vi det som en intravital human kræft metastase model, der giver mulighed for robust menneskelig kræft celle xenografting og real-time billeddannelse af kræft celle interaktioner med kollagen rige matrix og vaskulatur.
Ved hjælp af denne model blev en kvantitativ screeningsplatform designet til identifikation af nye drivere eller undertrykkere af kræftmetastase. Vi transduced en pulje af hoved og hals HEp3 kræftceller med en komplet menneskeligt genom shRNA genbibliotek, derefter injiceres cellerne, ved lav densitet, i CAM vaskulatur. Cellerne formeret og dannet enkelt-tumor celle kolonier. Individuelle kolonier, der ikke var i stand til at invadere cam-vævet, var synlige som en kompakt koloniphoenotype og fjernede for at identificere det transducerede shRNA, der var til stede i cellerne. Billeder af individuelle kolonier blev evalueret for deres invasivitet. Flere runder af valg blev udført for at reducere antallet af falske positiver. Individuelle, isolerede kræftcellekloner eller nyudviklede kloner, der udtrykker gener af interesse, blev udsat for primær tumordannelsesanalyse eller kræftcellevakulature co-option analyse. Sammenfattende præsenterer vi en hurtig screeningsplatform, der giver mulighed for antimetastisk målidentifikation og intravital analyse af en dynamisk og kompleks kaskade af begivenheder.
Metastase er hovedårsagen til kræftpatientdød1,2,3. Metastatiske kræftceller udnytte forskellige signalering veje, afhængig af typen af kræft, i hele de fem trin i den metastatiske kaskade: lokal invasion, intravasation, overlevelse i omløb, ekstravasation, og koloni ekspansion på fjerne metastatiske steder. Nuværende forståelse af denne metastatiske proces tyder på, at der er to flaskehalstrin, den ene er retningsbestemt invasion af kræftcellen fra den primære tumor, og den anden er etableringen af det fjerne sted metastatisk læsion4,5,6. Begge trin kræver kræftceller til aktivt at interagere med kollagen og vaskulatur på de steder, hvor den første invasion eller fjern metastatisk læsion dannelse. Derfor skal metastatiske kræftceller være i stand til at knytte til celler, remodel kollagenfibre og retningsvis invadere langs vaskulære vægge7. Screening modeller, der hurtigt kan identificere antimetastatic terapeutiske mål for at blokere kræftceller fra at fuldføre disse trin er af største betydning. Eksisterende in vitro-screeningsmodeller efterligner ikke fuldt ud det komplekse levende vævsmiljø. Musemodeller er dyre og tidskrævende. Der er derfor et presserende behov for intravitale screeningsplatforme, der giver komplekse levende vævsmiljøer og hurtig identifikation af mål.
Inden for det sidste årti er kyllingembryoet blevet etableret som en robust og omkostningseffektiv model for human kræftmetastase8,9,10,11,12. Den chick chorioallantoic membran (CAM) væv er tynd og gennemskinnelig, hvilket gør det ideelt til intravital mikroskopisk billeddannelse af celle og koloni adfærd i primær tumor og / eller metastatiske steder12. Primær tumor vækst fra flere menneskelige kræft cellelinjer kan indledes og metastaseres inden for en span på kun flere dage efter microinjection i CAM væv. Kræftceller kan administreres i CAM væv på flere måder, herunder intravenøst, intra-CAM eller som kollagen onplanter, denne fleksibilitet gør det muligt for forskeren at fokusere på specifikke stadier af kræft progression, for eksempel metastatisk læsion dannelse, invasion ud af den primære tumor eller angiogenese.
Her beskriver vi en kvantitativ screeningsplatform, der kan bruges til at måle kræftcellers evne til at etablere invasive metastatiske læsioner. Kræftceller, der er blevet transduceret med et udtryk bibliotek injiceres intravenøst i CAM vaskulatur ved lav densitet. Metastatiske kolonier dannes i 4-5 dage, så evalueres invasionskapaciteten og vasulaturinteraktionen af de resulterende kolonier. Individuelle kolonier, der undlader at invadere er fjernet, formeret og deres fænotype er bekræftet i CAM ved tilbagetjektion og kvantificering af koloni kompakthed og kræft celle-blodkar kontakter. Udtryksbibliotekets konstruktioner, der er ansvarlige for den enkelte metastatiske koloni mutant fænotype, identificeres fra isoleret kolonigenomisk DNA via høj gennemløbssekvensering. Den samme platform kan yderligere anvendes til at validere årsagssammenhængen mellem et gen og den observerede fænotype eller til at udføre dybdegående mekanistiske undersøgelser af den observerede fænotype.
Her beskriver vi en hurtig fluorescensmikroskopi baseret intravital screening protokol, der kan bruges til vigtige applikationer såsom genetiske eller lægemiddelkandidat skærme. Kræftceller, der er blevet transduceret med et genetisk bibliotek af interesse eller transfected med individuelle udtryk konstruktioner kan hurtigt screenes og kvantificeres med hensyn til fænotype af interesse ved hjælp af denne chick CAM model. Da transduktions- eller transinfektionsprotokoller varierer betydeligt, afhængigt af bibliotek…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 til JDL og KS. Dr. Lewis har Frank og Carla Sojonky Chair i Prostatakræft Forskning støttet af Alberta Cancer Foundation.
1 mL disposable syringes | BD | BD309659 | |
15 mL conical centrifuge tubes. | Corning | CLS430791-500EA | |
18 gauge x 1 1/2 BD precision needle | BD | BD305196 | we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred |
2.5% Trypsin solution | many sources are available | ||
4T1 mouse breast cancer | ATCC | CRL-2539 | |
B16F10 mouse melanoma cell line | ATCC | CRL-6475 | |
Benchtop centrifuge. | many sources are available | Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable | |
Circular coverslips, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
Confocal microscope | We use Nikon A1r | ||
cotton swabs | many sources are available | must be sterilized before use | |
Culture media appropriate for the cell lines used | many sources are available | We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media | |
Egg incubator | many sources are available | An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
eppendor tubes , 1.5ml | Sigma | T4816-250EA | |
Fertilized White Leghorn eggs | any local supplyer | ||
fine forceps | many sources are available | must be sterilized begfore use | |
Hemocytometer | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
HT1080 human fibrosarcoma cell line | ATCC | CCL-121 | |
Image analysis software | We use Nikon Elements | ||
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening |
MDA-MB-468 human breast cancer | ATCC | HTB-132 | |
PBS (1x) | many sources are available | ||
Plastic weighting dishes | Simport | CA11006-614 | dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available |
small surgical scissors | many sources are available | must be sterilized before use | |
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes). | VWR | CA25378-115 | dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available |
Stereo fluorescent microscope | We use Zeiss Lumar v12 | ||
Tygon R-3603 laboratory tubing | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness |
U-118 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-15 | |
U-87 MG human glioblastoma | ATCC | HTB-14 | |
Vertical pipette puller | many sources are available | we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720 |