Il metodo presentato consente la visualizzazione di proteine cellulari etichettate fluorescentmente con microscopia di espansione che porta a una risoluzione di 70 nm su un microscopio convenzionale.
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Articolo metodologico
Imaging di proteine podocitiche Nefrrina, Actina e Podocina con microscopia di espansione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'interruzione del filtro glomerulare composto dall'endotelio glomerulare, dalla membrana basale glomerulare e dai podociti, si traduce in albuminuria. I processi del piede dei podociti contengono fasci di actina che si legano alle proteine dell'adattatore citoscheletricho come la podocina. Queste proteine dell'adattatore, come la podocina, collegano la spina dorsale del diaframma a fessura glomerulare, come la nefrina, all'actina citoscheletro. Studiare la localizzazione e la funzione di queste e di altre proteine podocitiche è essenziale per la comprensione del ruolo del filtro glomerulare nella salute e nelle malattie. Il protocollo presentato consente all'utente di visualizzare actina, podocina e nefrrina nelle cellule con imaging a super risoluzione su un microscopio convenzionale. In primo luogo, le cellule sono macchiate con una tecnica di immunofluorescenza convenzionale. Tutte le proteine all'interno del campione vengono quindi covalentemente ancorate a un idrogel gonfiabile. Attraverso la digestione con proteinasi K, le proteine strutturali vengono scissa permettendo gonfiore isotropico del gel nell'ultimo passaggio. La dialisi del campione in acqua si traduce in un'espansione di 4-4,5 volte del campione e il campione può essere immaginato tramite un microscopio a fluorescenza convenzionale, rendendo una risoluzione potenziale di 70 nm.
Introduzione
L'albuminuria è un parametro surrogato del rischio cardiovascolare e deriva dall'interruzione del filtro glomerulare1. Il filtro glomerulare è composto dall'endotelio fenestrato, dalla membrana basale glomerulare e dal diaframma a fessura formato dai podociti. I processi del piede primario e secondario dei podociti avvolgono la parete capillare del glomerulum2. La delicata struttura dei processi del piede è mantenuta da fasci di actina corticale che fungono anche da ancore per proteine del diaframma a fessura multipla e altre proteine dell'adattatore2. La proteina dorsale del diaframma fessurato è....
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Protocollo
1. Scissione e semina di cellule
- Riscaldare il mezzo dell'aquila modificata (DMEM) sterile di Dulbecco, incluso il siero di vitello fetale al 10% (FCS), la salina tamponata di fosfato sterile (PBS) e la tripside sterile a 37 °C. Attivare la panca pulita.
- Preparare una piastra da 6 pomp po' aggiungendo un foglietto di copertura sterile in vetro (10 mm) a ciascun pozzo utilizzando forcep sterili.
- Metti un piatto di coltura cellulare di 10 cm con celle Cos7 sotto la panca pulita. Sotto il banco pulito, aspirare il mezzo delle cellule utilizzando un dispositivo a vuoto.
- Tenere il piatto di coltura cellulare angolata in una mano e a....
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Risultati
Il concetto e la tempistica di questo protocollo proExM sono illustrati nella figura 1. Il giorno 5, le cellule trasfette sono fisse e macchiate con anticorpi fluorescenti mirati alla proteina di interesse(Figura 1A,B). Il giorno 6, il trattamento con AcX porta alla formazione di gruppi amminici su tutte le proteine (compresi i fluorofori)(Figura 1A,B)
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Discussione
Il metodo presentato consente allo sperimentatore di visualizzare proteine cellulari, ad esempio podocina, nefrrina e componenti citoscheletrici, ad esempio F-actina. All'interno di questo protocollo, le cellule cos7 trasfette sono usate come modello per studiare l'interazione delle proteine del diaframma a fessura con f-actina. Sfortunatamente, le linee cellulari dei podociti immortalate non esprimono quantità endogene sufficienti di proteine del diaframma fessurato19.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Blanka Duvnjak e Nikola Kuhr per l'eccellente assistenza tecnica.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acrilammide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acriloil)ammino)acido esanoico, succinimidil estere, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | conservare fino a 4 mesi |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckglä ser (occhiali di copertura) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | per il taglio dei vetrini coprioggetto |
| Guanidina HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock può essere conservato presso RT |
| Marten pennello per capelli | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckglä ser (copribicchieri) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N'-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträ ger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinasi K | New England Biolabs | P8107S | |
| Acrilato di sodio | Sigma-Aldrich | 408220 | controllare la purezza |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Camera | prodotta presso l'officina dell'università | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| Piastre di fondo in vetro a 6 pozzetti | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | cromo | non disponibile | 1:40 |
| Anti Podocin prodotto in coniglio | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Asino anti porcellino d'India CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Capra anti coniglio 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| porcellino d'India anti nefrine | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non disponibile |
Riferimenti
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P.
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Ristampe e permessi
